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酶工程综述 胰蛋白酶 一 摘要 胰蛋白酶为蛋白酶的一种，在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。在生物体内，胰蛋白酶抑制剂可以调控很多重要的生理过程，在疾病的临床诊断、治疗等方面都有广阔的应用前景。 二 胰蛋白酶的简介 胰蛋白酶为蛋白酶的一种，在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。 在生物体内，胰蛋白酶抑制剂可以调控很多重要的生理过程，在疾病的临床诊断、治疗等方面都有广阔的应用前景。广泛的应用于急性胰腺炎、外科手术、脑血管疾病、妇产科疾病、休克以及抗肿瘤治疗中新型药物的开发。 牛的胰蛋白酶氨基酸残基223个，分子量为23300，活性部位的丝氨酸残基是不可缺少的丝氨酸蛋白酶。除存在于脊椎动物外，还存在于蚕、海盘车、蝲姑、放线菌等范围广泛的生物体中。另外与高等动物的血液凝固和炎症等有关的凝血酶、纤溶酶、舒血管素等蛋白酶在化学结构和特异性等方面与胰蛋白酶具有密切的关系，可以认为这些酶是从共同的祖先酶在进化过程中分化而来的。胰糜蛋白酶与弹性蛋白酶在结构和催化机制方面也具有密切关系，但其特异性则完全不胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。中国药品标准规定按干燥品计算，每1mg 的效价不得少于2500单位。 由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。白色或米黄色结晶性粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24 000，pI 10.5，最适pH值7.8～8.5左右。pH9.0不可逆失活。Ca2+对酶活性有稳定作用；重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。临床用于抗炎消肿，工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。还常用于动物细胞培养前对组织的处胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH 为 8.0 、温度为 37℃ 时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组分。收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。一般经过2～3次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到8000～10000BAEE单位/毫克蛋白，或更高。试剂和器材 试剂pH2.5乙酸酸化水2.5mol/L H2SO4。 （3）5 mol/L NaOH。 （4）2 mol/L NaOH。 （5）2mol/L HCl。 （6）0.001M HCl。 （7）硫酸铵氯化钙。 0.8 mol/L pH9.0硼酸缓冲液：取20ml 0.8 mol/L硼酸溶液，加80ml 0.2 mol/L四硼酸钠溶液，混合后，用pH计检查校正。 0.4 mol/L pH9.0硼酸缓冲液（用0.8 mol/L稀释1倍即可）；0.2 mol/L pH8.0硼酸缓冲液：取70ml 0.2