DNA提取纯化[精].pptVIP

基因工程需要三种不同的DNA: 全细胞DNA(总DNA, total cell  DNA) 质粒DNA 噬菌体DNA 学习内容： 制备细胞总DNA 培养、搜集细菌细胞 制备细胞提取物 DNA纯化、浓缩 质粒DNA提取 根据分子大小分离 根据结构分离 质粒扩增 提取噬菌体DNA 噬菌体的培养、收集、纯化 纯化M13 DNA 1.制备总DNA 1.1培养、搜集细菌细胞 两种类型的细菌培养基的成分： M9培养基(确定成分培养基)：g/L Na2HPO4(6.0) KH2PO4(3.0) NaCl(0.5) NH4Cl(1.0) MgSO4(0.5) 葡萄糖(2.0) CaCl2(0.015) LB培养基(不确定成分培养基) ：g/L typtone(10) 提供氨基酸以及肽段 Yeast extract(5) 提供氮源、糖类、有机和无机营养 NaCl(10) 1.1培养、收集细菌细胞 1.2 制备细胞提取物 利用溶菌酶、EDTA或两者结合。 溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，能消化细胞壁的多聚物。 EDTA络合保持细胞结构完整的钙离子，也可以抑制DNA酶的活性。 提取液中同时还加入SDS，使细胞膜破裂，协助细胞壁的溶解。 1.3 DNA的纯化 去掉DNA以外的成分 蛋白酶K/苯酚——蛋白质 RNA酶——RNA DNA的浓缩 最常用的浓缩方法是乙醇沉淀（同时含有Na离子的条件下）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀（杂质）。 1.4 DNA的浓缩与浓度、纯度的测定 DNA浓度的测定 260nm下测定吸光度，1OD相当于50μg双链DNA/ml（ 40μg单链DNA或RNA/ml ）。 电泳检测 核酸具有结合染料的能力  DNA浓度的测定琼脂糖凝胶电泳检测 电泳检测 1.4 DNA的浓缩与浓度、纯度的测定 DNA纯度的测定 A260/A280=1.8，1.8 表示含有酚或蛋白质， 1.8说明有RNA。 CTAB法提取植物DNA 2 质粒DNA提取 根据质粒DNA的大小（质粒分子最大不超过大肠杆菌染色体的 8%） 根据DNA的构造 ◇碱裂解法 Alkaline denaturation ◇ EB—CsCl密度梯度离心法 Ethidium bromide-caesium chloride density gradient centrifugation 2质粒DNA提取 2.1 根据分子大小提取质粒DNA 在蔗糖存在时用EDTA和溶菌酶处理，可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整； 用非离子去垢剂如Triton X-100处理，诱导细胞裂解； 离心分离，小分子质粒位于裂解液上清；而细菌大分子DNA则沉淀下来。 2.1 根据分子大小提取质粒DNA 问题： 裂解液中不可避免的包含一些染色体DNA。 质粒分子非常大时 ，将与细胞残留物共沉淀。 2.2 根据分子构造提取 碱裂解法 在非常窄的pH范围内，非超螺旋化的DNA会变性，而超螺旋化的质粒DNA不变性。 在裂解液中加入氢氧化钠，调pH值至12.0~12.5，破坏氢键，使非超螺旋化的DNA变性。加入酸，变性的细菌DNA进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。 同时利用SDS裂解，KAc中和可以去掉大部分的蛋白质和RNA。上清液中只剩下超螺旋化的质粒DNA了。 2.2 根据分子构造提取 EB—CsCl密度梯度离心法 在较大的离心力条件下，CsCl形成梯度，生物大分子形成不同的条带，条带的位置取决于其浮力密度。 最上部是蛋白质，中间是DNA，下部是RNA。 2.2 EB—CsCl密度梯度离心法 EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，线形DNA大约会降低0.125g/cm3；但超螺旋的DNA结合EB少，浮力密度降低较小，仅降低0.085g/cm3。 EB可以用丁醇抽提。 CsCl可以用透析除去，纯度可达100%。 2质粒DNA提取 2.3 质粒扩增 一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成条件下复制的能力。当细胞增加到足够数目时，加入蛋白合成抑制剂如氯霉素，继续培养。在这个过程中，质粒分子继续复制，但染色体的复制和细胞分裂已经停止，可以获得上千个拷贝。 3 噬菌体DNA的制备 当培养物离心时，细菌沉淀到底部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋白就可以获得噬菌体DNA。 然而获得大量的噬菌体DNA是一个障碍。每ml菌液可以获得1010λ噬菌体，但只能产生500ngDNA。 3 噬菌体DNA的制备 3.1 噬菌体的培养 自然培养的λ噬菌体是溶源性的