青霉素發酵效价的生物学测定.docVIP

青霉素发酵效价的生物学测定 一、实验目的 1、了解青霉素作用的机理 2、了解青霉素效价的生物学测定的原理 3、掌握管碟法测量抗生素效价的方法 4、掌握青霉素摇瓶培养的操作流程 二、实验原理 （一）、青霉素及作用的机理 抗生素：是某些微生物在其代谢过程中所产生的，能抑制或杀灭其他病原微生物的化学物质；是细菌、真菌、放线菌等微生物的代谢产物。主要从微生物的培养液中提取，能杀死或抑制其他病原微生物。 在低浓度即可对某些生物的生命活动有特异一直作用的化学物质的总称。 2. 青霉素 天然青霉素系从青霉菌的培养液中提取获得，主要含有：青霉素F、G、X、K和双氢F五种。其中以青霉素G(又名苄青霉素)的作用最强，性质较稳定，产量亦较高。 青霉素G的结构： 青霉素钾、钠的结构： 青霉素钾盐、钠盐的性质： 遇酸、碱或氧化剂等迅速失效。 有引湿性；在水中极易溶解，乙醇中溶解，在脂肪油或液状石蜡中不溶。 水溶液在室温放置易失效；20万IU/ml青霉素溶液于30 ℃ 放置24h，效价下降 56%，青霉烯酸含量增加200倍，临床应用时要新鲜配制。（所以只有粉制剂，没有注射液，用时用注射用水稀释；如使用不完，放置不要过久）。 3. 青霉素作用机理 使细菌细胞壁缺损(黏肽)，菌体内的高渗透压使细胞外面的水分不断地渗入菌体内，引起菌体膨胀变形，加上激活自溶酶，使细菌裂解而死亡.G+ (二)青霉素效价的生物学测定的原理 1.效价:是评价抗生素效能的标准，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度 微生物鉴定法：以抗生素对微生物的杀伤力或抑制 程度为指标来衡量抗生素效价的方法 理化方法：根据抗生素的结构特点，利用其特有的化 学或物理性质及反应而进行的 抗生素活性表示方法：抗生素的活性以效价单位来表示;每ml或每mg中含有某种抗生素的有效成分的多少，用单位u表示 一个青霉素效价单位：能在50mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌发育的最小青霉素剂量;以IU表示 1mg青霉素G钠盐定为1667单位；1mg青霉素G钾盐为1595单位 (三) 管碟法测量抗生素效价的方法 1.利用抗生素在培养基内的扩散渗透作用，将已知效价的标准品溶液与未知效价的被检品溶液在同样条件下加入已放置在含有高度敏感性的试验菌的培养基上的小管内 2.培养后，在抗生素扩散到达的适当范围内，产生了透明的抑菌圈。不同浓度的抗生素，抑菌圈的大小不同；比较标准品与检品的抑菌圈大小，利用不同的计算原理，就可以推算出此抗菌素的效价 (四)青霉素摇瓶培养的操作流程 1.菌种活化:从保藏菌种接种到灭菌的斜面培养基中,25℃培养6-7天;待斜面上长满菌苔后作为以及菌种制备的起始菌株 2.一级斜面菌种制作:从起始菌株斜面接种到灭菌的斜面培养基, 25℃培养6-7天,如无杂菌污染及为一级斜面菌种 3.摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基, 25℃、200rpm培养6-7天,可进行青霉素的效价测定等 4.发酵罐培养: 流程：冷冻管 → 斜面母瓶（1） → 大米孢子（ 2）→ 一级种子罐（3 ）→ 二级种子罐 （4）→ 发酵罐（5）→ 放罐 至提炼 各步所需培养条件： 1. 25℃，6—7天； 2. 25℃，6—7天； 3. 25℃，40—45h，1：2VVM(每分钟通气体积比) 4. 25℃， 13—15h， 1：1.5VVM; 5. 22-26℃，6—7天，1：1—0.8VVM。 三. 实验材料 1.菌种 产黄青霉菌(Pentcillium chrysogenum) 金黄色葡萄球菌(Staphyloco ccusauoreus) 2.药品 青霉素钠 0.2mol/L pH 6.0磷酸缓冲液 0.85%生理盐水 发酵培养基 生物测定培养基 3.仪器及器皿 移液枪 无菌枪头 接种环 酒精灯 烧杯 培养皿 滴管 试管 超净工作台等 四. 操作步骤 1.发酵培养基的配制:按照配方配制液体培养基，250ml三角瓶装液量为100ml。 2.摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基, 25℃、200rpm培养6-7天,可进行青霉素的效价测定 3. 青霉素标准溶液的配制:准确称取纯苄青霉素钠0.06g,溶解在pH 6.0的磷酸缓冲液, 配成100ml 1000单位/ml的青霉素标准工作液.按下表加入青霉素标准溶液 1mg青霉素G钠盐定为1667单位1000/1667 mg = 0. 6mg 1000单位 100ml 1000单位/ml 100*0.6mg=0.06g 称取0.06g 苄青霉素钠溶于100ml的磷酸缓冲液 不同浓度青霉素标品溶液的配制 试管号 青霉素浓度 (单位/ml) 1000单位/ml