脂肪酶的分离纯化及酶学性质.docVIP

PAGE 15 第1章 脂肪酶生产菌的筛选及鉴定 在自然界中，脂肪酶主要存在于动物、植物和微生物当中。由于脂肪酶种类繁多，尤以微生物中最多，且作用温度范围及pH都比动植物脂肪酶广，所以微生物脂肪酶在基础研究和实践应用中更为重要。获取一株高效脂肪酶生产菌是实验的关键。本实验从甘肃不同地区农田、石油污染及油脂污染土壤样品中，富集培养、分离筛选出高效脂肪酶生产菌，结合生理生化试验及16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定。 本章从不同来源的样本出发，通过平板晕圈法对其进行初步定向筛选，确定了有脂肪酶生产能力的微生物。以初选得到的微生物为基础，继续培养观察后，筛选出了一株高效脂肪酶生产菌Mhy-1，对其进行了细菌形态观察，并通过生理生化特征及16S rDNA对菌株进行鉴定。结果表明：菌株Mhy-1菌落呈淡黄色，边缘光滑整齐，表面湿润，细胞呈短杆状，革兰氏阴性，大小为(0.3-0.5)μm×(0.1-0.2)μm，不产芽孢。根据菌株16S rDNA序列同源性分析构建的系统发育树，结果表明：菌株Mhy-1的16S rDNA序列与杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)相似性为100%，结合细菌培养特性、生理生化特征及16S rDNA序列分析，初步确定其为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。 1.1 实验材料与仪器 1.1.1 样品的采集 本实验样品以甘肃不同地区农田、油脂污染及石油污染土壤作为采样点。选择离地面10-20cm处的土壤作为采样点。将样品盛于预先灭菌的牛皮袋中，扎紧口袋、标明时间、地点等情况，以备考察。 1.1. 主要实验仪器见表2.1。 1.1.3 主要试剂 蛋白胨、酵母粉（上海生工生物工程股份有限公司，分析纯）；橄榄油（上海生工生物工程股份有限公司，商业级）；Tween-80（莱阳双双化工有限公司，化学纯）；对硝基苯丁酸酯（天津希恩思生化科技有限公司，分析纯）；限制性内切酶、dNTP、T4 DNA连接酶、Taq DNA 聚合酶等（大连宝生物工程有限公司）；DNA凝胶回收纯化试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；琼脂糖、GelRed、Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）；其余均为国产分析纯。 1.1.4 培养基及溶液 1.1. 脂肪酶活性检测培养基：1% 蛋白胨，0.01% CaCl2·H2O，1% NaCl，1.5% 琼脂，1% Tween-80，pH 7.0。121℃高压灭菌20min LB液体培养基：1% 蛋白胨，1% NaCl，酵母粉0.5%，pH7.0。121℃ 1.1.4 (1)革兰氏染色试剂 草酸铵结晶紫混合液： 甲液：结晶紫2.0g溶于20 mL 95％的乙醇中 乙液：草酸铵0.8g溶于80mL蒸馏水中 将甲、乙两溶液混合，静置48h后过滤使用。储存备用。 碘液：先用4-5mL蒸馏水溶解碘化钾2.0g，再缓慢加入1.0g碘片，待碘片全溶解后混匀，加蒸馏水定容到300mL。 脱色液：95％乙醇。 番红复染液：称取番红1.25g溶于50mL 95％乙醇，溶解完全后储存于密闭棕色瓶中，使用时取与蒸馏水按1:4的比例 (2)芽孢染色试剂 孔雀绿染液：称取孔雀绿2.5g溶于50mL蒸馏水，混匀保存备用。 碱性复红染液：碱性复红0.0025g溶于50mL 95％的乙醇，混匀保存备用。 (3)50×TAE电泳缓冲液 称取242g Tris碱，37.2g Na2EDTA 2H2O和57.1g冰乙酸，加去离子水定容至1000mL。保存备用。 1.2 实验方法 1.2.1 脂肪酶产生菌的筛选 1.2.1 称取采集的土壤样品10.0g溶于100mL无菌水中，充分振荡后，静置2-3h。然后依次稀释10、102、103、104倍，对于污水样品直接稀释。用已灭菌的枪头吸取30μL稀释液分别涂布于脂肪酶检测培养基表面，30℃恒温培养24h后，观察菌落周围晕圈产生情况，挑选晕圈明显的单菌落，采用平板划线法，经多次分离纯化得到脂肪酶产生菌株，并用 1.2.1 本实验采用甘油菌悬液保藏法。 挑选产脂肪酶活力高的菌株，将已纯化的单菌落从脂肪酶检测培养基中挑出，于灭菌的LB液体培养基内，30℃、150r/min条件下恒温振荡培养12-16h。在无菌条件下用移液抢吸取灭菌后的甘油，加入到菌悬液中（甘油终浓度为20%），在振荡器上充分混合均匀，将混合液分装到保菌管中，于-70 1.2.2 脂肪酶活性检测 1.2.2 以Tween-80为乳化剂，配制脂肪酶活性检测培养基，利用打孔器在脂肪酶活性检测培养基上打孔，并在孔内加入20μL粗酶液，于一定温度下放置24h。根据脂肪酶能水解脂肪酸甘油三酯，释放出脂肪酸和甘油的特性，用游标卡尺测定反应后生成的透明圈直径，透明圈直径越大，脂肪酶活性则越