亲环蛋白A对PRRSV增殖的影响及其作用机制研究(可编辑).docVIP

为了研究干扰Marc-145细胞中内源性的CypA对PRRSV增殖的影响，我们设计合成了猴源CypA的干扰分子（由上海吉玛公司设计并合成），序列分别为： si-CypA-F：5’-CCUGCUUUCACAGAAUUAUTT-3’ si-CypA-R：5’-AUAAUUCUGUGAAAGCAGGTT-3’ si-NC-F：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’ si-NC-R：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’ 并且设计合成了CypA的定量引物，实时荧光定量PCR引物见表4-1，Marc-145细胞接24孔细胞培养板，待细胞生长至70%-80%时转染CypA的siRNA，同时设立NC为对照组。转染换液后24 h收取细胞样品，Trizol法提取细胞总RNA，并通过Real-time PCR实验检测CypA mRNA的表达变化情况，图4-4（A）结果显示，合成的猴源si-CypA能有效抑制目的基因CypA的表达，干扰效果约为62%。与此同时，我们通过Western Blot实验在蛋白水平对si-CypA的干扰效果进行了验证，与Real-time PCR结果相似，si-CypA能够显著抑制CypA蛋白的表达，如图4-4（B）。说明合成的si-CypA能有效抑制目的基因猴源CypA的表达。 4.2.3 空斑检测超表达及干扰CypA对PRRSV增殖的影响 M