6聚丙烯酰胺凝膠垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶.docx

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶植物098 原硕 0901080808摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配置等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。关键字：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，同工酶研究背景及目的：同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。它们是DNA编码的遗传信息表达的结果。最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等有一定关系。因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高、重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。过氧化物是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一种时期植物体内代谢的变化。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配置等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。研究依据及原理：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，N，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。电泳现象：带电粒子在电场中向与其自身相反电荷的电极移动。由于带电胶粒或分子中各种成分，所具有的电荷和分子量不同，在电场中将以不同的速度移动，因而在电泳进行过程中，不同的成分将按照各自的迁移速度得到有效地分离。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。电荷效应；分子筛效应样品；浓缩效应。过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，叫做组织的多态性，体现各组织的特异功能。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能，例如动物肝脏的碱性磷酸酯酶和肝脏的排泄功能有关，而肠粘膜的碱性磷酸酯酶却参与脂肪和钙、磷的吸收。对LDH催化的可逆反应，心肌中富含的LDH1及LDH2在体内倾向于催化乳酸的脱氢，而骨骼肌中丰富的LDH4及LDH5则有利于丙酮酸还原而生成乳酸。所以同工酶只是做相同的“工作”（即催化同一个反应），却不一定有相同的功能。联邻茴香胺在酸性,低温条件下与亚硝酸作用生成四氮盐.四氮盐有两个重氮盐,其中一个重氮基在碱性条