实验常用仪器学总结.ppt

实验常用仪器学 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR) PCR技术的主要用途 （一）核酸的微量分析 （二）基因的体外突变，多态性研究 （三）目的基因的克隆，序列分析，定点诱变等研究 PCR扩增条件的设定 94℃, 300S （预变性） 94℃, 30S（变性） 25 ～40cycles 55~65℃, 30S 72℃, 30~120S （退火温度，与引物Tm值有关） 72℃, 10min PCR程序的正确设定决定产物质量 模块材质决定着升降温速率快慢 各种类型的PCR仪 PCR仪的使用注意事项 保持仪器附近的桌面清洁，保持仪器的清洁。 反应量不大时在模块的四个角上放置空PCR管支撑热盖。 最后一步保存反应设定温度15℃，不要设为4 ℃。 保持一个反应和另外一个反应之间空闲5分钟，确保模块温度恢复至室温，关机前也必须等待模块温度降至室温方可关闭电源。 勿使用蛮力强行打开热盖；热盖高温，避免烫伤。 严格按照操作规范进入程序编辑窗口。 PCR产物的鉴定（一） －凝胶电泳 ? 琼脂糖凝胶 ———用于分离100－10000bp的片段; 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 ? 聚丙烯酰胺凝胶 ———用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA 琼脂糖凝胶电泳实验原理 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定核酸最常用的方法。 在pH8.0的缓冲液中，核酸带负电荷，在电场中向正极移动，由于分子筛效应，可将分子大小和构象不同的核酸分子分离，不同浓度的凝胶可分离不同分子大小的DNA片段。 丙烯酰胺浓度与分离DNA分子的有效范围 核酸水平电泳装置： 荧光染色原理： 核酸的荧光染料如溴化乙锭（EB)、SYBR Green I等嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在 UV 激发下发出荧光。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。 DNA Marker （五）凝胶成像分析仪 （五）凝胶成像系统 凝胶成像仪器保养要求 电脑开启时请勿突然断电，以防硬盘损坏导致实验资料的丢失。 电脑及主机电源开启时，请勿插拔信号连接线以防烧坏硬件。 实验资料定期备份，以保证实验资料的安全。 如用紫外灯源，拍摄完毕后请立即关闭灯源电源，以延长紫外灯管及紫外滤光片的使用寿命。 紫外投射光源在拍完胶后，请用软纸及无水乙醇擦净玻璃表面，以防含盐量高的电泳缓冲液干结于紫外玻璃表面影响以后的图像质量和紫外线的透过强度。 核酸序列分析（nucleic acid sequence analysis)技术是用人工的方法测定并分析核酸的碱基组成及排列顺序，即核酸一级结构的测定。 PCR产物的电泳结果 TaqMan 探针 标准曲线 定量PCR结果 在实际操作中， Ct值定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著荧光发射时所对应的PCR循环次数。 ? Ct值越小，模板DNA的起始拷贝数就越多；Ct值越大，模板DNA的起始拷贝数就越少。 ?正常的Ct值范围在18～30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。 Ct值与起始模板量存在线性对数关系 熔解曲线分析 反应体系中存在少量的非特异聚合体（如引物二聚体，非特异性扩增产物等），引起干扰； 但非特异聚合体的熔解温度通常较特异性结合低； 扩增结束后对扩增产物进行连续动态监测可得熔解曲线； 通过熔解曲线分析，将非特异性信号和特异性信号区分出来； 熔解曲线分析 SYBR Green I 反应产物的熔解曲线分析 熔解曲线 DNA 结合染料(SYBR Green I) 荧光共振