免疫学1234567890精选.ppt

吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第*页 吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第*页 吉林大学国家级生物实验教学示范中心 第*页 * * 免疫学-创新实验设计 虎眼万年青多糖对小鼠免疫功能的调节作用 小组成员；李河川 王志高 李世学 刘有为 李天才 孟晓光 设计流程： 实验背景 实验构想 实验设计路线 预期结果 讨论 实验价值 参考文献 实验背景； 近年来研究表明,广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中的多糖类物质能提高机体免疫功能,它不仅能促进T细胞、B细胞、MΦ细胞等免疫细胞的功能,还能促进细胞因子的生成。 实验构想； 60%醇浓度的中性多糖(S3) 在小鼠体液免疫、细胞免疫的调节作用进行了研究,同时,通过流式细胞术客观地对T淋巴细胞亚群的变化进行了检测,并利用RT2PCR方法检测了S3对脾细胞中细胞因子IL22 mRNA表达水平的影响,从细胞和分子水平对其免疫调节作用机制进行了研究。 实验设计路线 实验准备 S3的制备 虎眼万年青全草经80%乙醇回馏脱脂后,用热水反复提取,提取液浓缩至一定体积后,离心除去杂质,醇沉,使乙醇终浓度达60%,沉淀反复用水无醇、乙醚、丙酮处理,得淡黄色粉末,真空干燥后即得S3。 实验动物　 小鼠,6～8周龄,雄性,体重18～20g, NK敏感细胞株Yac21细胞 实验步骤； 约药方案 每天I g给药一次,剂量为蒸馏水对照组20mlΠkg体重,S3高、中、低三个剂量组分别配成5%的悬浊液,30mlΠ(kg·d)体重,每天014 ml,连续给药10 d。 体液免疫试验方法　 参照一种改进的体液免疫功能测定方法———溶血素测定方法7,提取上述保存的绵羊红细胞,使红细胞浓度为每毫升约20亿个。按每只鼠012 ml腹腔注射,免疫4 d后,将小鼠处死,摘除小鼠眼球,将每只小鼠血分别滴至小试管内,室温放置1 h,使血清充分渗出后离心,上层血清用生理盐水稀释后取1 ml,再加入015 ml绵羊红细胞。置于冰浴水中冷却,加入1 ml补体,离心,取上清液1 ml及3 ml都氏度剂,振荡均匀,放置10 min后,于540 nm波长下比色,测定样品及绵羊红细胞半数溶血时的OD值。 淋巴细胞转化试验　 将小白鼠颈椎脱臼处死,无菌取脾,制备脾细胞悬液,细胞浓度为1×106个Πml,重量。取小鼠脾脏,夹碎,研磨,过滤后用含10%小牛血清的IMDM培养液配制1×106个Πml浓度的单细胞悬液。取100μl于96孔培养板中,加入有丝分裂原1010μgΠmlConA,每孔终体积为200μl。37℃培养48 h后加入3H2TdR2μCiΠ孔,继续培养12 h后收获。用多头细胞收集器将细胞收集于纤维素滤膜上,用蒸馏水反复冲洗,再滴加5010gΠL三氯醋酸2 ml,使样品固定,无水乙醇2 ml流洗脱色后,置于80℃烘箱内干燥30 min。将烘干的内滤膜放入盛有5 ml闪烁液的测量杯中,置于液体闪烁仪中c pm值。每份样品测3个复孔。 NK细胞活性测定试验　 参照3 H2TdR后标记法8,取Yac21细胞和效应细胞悬液各50μl(效靶比为100∶1),加入96孔培养板中,再加入011 ml培养液,同时设效应细胞和靶细胞对照,置于37℃,5%CO2箱中培养6 h。渗入015μCiΠ20 ml的3 H2TdR,培养6 h后收获。用多头细胞收集器将细胞收集于纤维素滤膜上,用蒸馏水反复冲洗,再滴5010gΠL氯醋酸2 ml,使样品固定,无水乙醇2 ml流洗脱色后,置于80℃烘箱内干燥30 min。将烘干的滤膜放入盛有5 ml闪烁液的测量杯中,置于液体闪烁仪中测c pm。每份样品测3个复孔。 白细胞介素2(IL22)活性测定试验　 取1×106个Π ml浓度的小鼠脾细胞单细胞悬液100μl于96孔培养板中,加入有丝分裂1010μgΠml Con A,每孔终体积为200μl。取上清冻存于-20℃。参照小鼠IL22 ELISA试剂盒,测量OD450值。 流式细胞术测定试验　 取1×107个ml浓度的小鼠脾细胞单细胞悬液100μl于小离心管中,分别加入FITC标记的CD3,PE标记的CD4、CD8抗体10μl,振荡混匀,室温、避光放置30 min,用PBS洗涤2遍,再加入500μl的PBS混匀,10 min后用流式细胞仪检测CD3、CD4、CD8、CD4ΠCD8阳性表达率。 预期结果； 1、将不同浓度S3处理后的小鼠淋巴细胞与Con A共同培养48 h,结果低、中、高剂量组均能明显增强有Con A诱导的淋巴细胞增殖能力,与对照组比较,有极显著性差异。 2、将不同浓度S3处理后的效应细胞与靶细胞共同培养6 h,结