WesternBlot標准操作规程.doc

研究机构名称：中国药科大学药代动力学重点实验室 SOP编号： SOP名称：Western Blot免疫印记法标准操作规程 1. 目的 本SOP的目的是为了保证Western Blot免疫印记实验的标准化和可重复性。 前言 本SOP涉及蛋白样品的Western Blot免疫印记实验的标准化操作过程。 范围 本SOP适用于中国药科大学药代动力学重点实验室的全体实验操作人员。 职责 4.1 细胞室PI应指派专人负责Western Blot免疫印记实验前的培训。 4.2所有实验操作者应经由专人培训，明确Western Blot免疫印记实验的原理及步骤后方可独立操作。 操作 5.1 试剂配制 5.1.1 储备液 （1）PMSF (100mmol/L) 称取PMSF17.4mg，异丙醇定容至1 ml，－20℃保存。2）裂解液 购于碧云天，1mL/tube分装，－20℃保存，使用前加入PMSF10μL/1mL裂解液（PMSF终浓度1 mmol/L）。 （3）Tris-HCl 1M pH 6.8 称取Tris 12.11g，超纯水定容至100ml，浓盐酸调pH值。 （4）Tris-HCl 1.5M pH 8.8 称取Tris 18.16g，超纯水定容至100ml，浓盐酸调pH值。 （5）10％ SDS 称取SDS 10 g，超纯水定容至100ml，室温保存，如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。（6）10％ 过硫酸胺 称取过硫酸胺0.1 g，超纯水定容至1 ml，4℃保存，保存时间为1周。5.1.2 工作液电泳缓冲液 14.4g 甘氨酸 3.0g Tris 1.0g SDS 超纯水定容到1000ml4℃保存转膜缓冲液 2.93g 甘氨酸 5.82g Tris 0.37g SDS 200ml 甲醇 超纯水定容到1000ml4℃保存10×TBS 24.2g Tris 80g NaCl 超纯水定容到1000ml，用浓HCl调pH到7.64℃保存1×TBST 10×TBS 100ml Tween-20 1ml 超纯水定容到1000ml4℃保存超纯水定容到1000ml4℃保存超纯水定容到1000ml4℃保存（7）封闭液 5%脱脂奶粉：称取脱脂奶粉5g，用1×TBST 100ml溶解，4℃保存，也可根据实际需要配制其他封闭液 （8）抗体 用TBST稀释至一定浓度使用5.2 操作步骤 5.2.1 蛋白样品制备 （1） 单层贴壁细胞的总蛋白提取：① 弃去培养液，每瓶细胞加1~2ml 4℃预冷的PBS，平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。 ② 每瓶细胞加1ml 4℃预冷的PBS，在冰板上操作将细胞刮下，4°C 离心1500rpm/5min，弃上清，再以PBS洗1~2次； ③ 离心后在沉淀中加入100~150μL RIPA裂解液（使用前每毫升裂解液中加入1μL 浓度为100mM 的PMSF 异丙醇溶液） ④ 冰浴裂解20min，冰浴超声3s/次，共6 次； ⑤ 4°C 离心10000rpm/10min离心； ⑥ 离心后取上清，分装于20℃保存。(2) 单层贴壁细胞的膜蛋白提取 ① 同总蛋白提取①~④； ② 4°C 离心500g/10min，沉淀为细胞碎片； ③ 取上清继续4°C 离心20000rpm/60min，上清为胞浆蛋白，沉淀为细胞膜蛋白分装于20℃保存（1）6％浓缩胶 5％浓缩胶（两块胶，4ml） 超纯水 2.6 ml 30％Acr/Bic 1.0 ml 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 1.3 ml 10％SDS 50 μl 10% APS（过硫酸胺） 50 μl TEMED 4 μl 后两种试剂为促凝剂，加入后立即混匀即可灌 (2)分离胶配制 （总体积全部为10 ml） 胶浓度 6 % 8 % 10 % 12 % 15 % 水 5.3 ml 4.6 ml 4.1 ml 3.3 ml 2.3 ml 30%丙烯酰胺 2.0 ml 2.7 ml 3.3 ml 4.0 ml 5.0 ml 1.5M Tris (pH 8.8) 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 10% SDS 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 10% AP（过硫酸胺） 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml TEMED 8 μl 6 μl 6 μl 4 μl 4 μl 后两种试剂为促凝剂，加入后立即混匀即可灌胶 (3)不同浓度分离胶的最佳分离范围 SDS分离胶浓度 最佳分离范围 6%胶 50 ~ 150kD 8%胶 30 ~ 90kD 10%胶