【2017年整理】溶组织内阿米巴培养.docVIP

PAGE 5 寄生虫的人工培养及动物模型 第一节 寄生虫的人工培养 一、溶组织内阿米巴培养 可分有菌培养(xenic culture)和无菌培养(axenic culture) （一）有菌培养 主要用Robinson’s培养基，不仅可以培养溶组织内阿米巴，也可以培养哈门氏内阿米巴、结肠内阿米巴、微小内蜒阿米巴等多种阿米巴。一般应用6ml~7ml或更小的螺旋有盖培养管。 1．组成成分： （1）盐水琼脂斜面：溶解15g琼脂粉和7g~8g氯化钠于1000ml蒸馏水中，分装在小试管中高压灭菌(121℃,15min)，当琼脂冷却至75℃左右倾放使其形成斜面。 （2）红霉素：将0.5g实验室用红霉素粉剂置于无菌容器中，加入20ml 70%乙醇溶解，4℃放置2h以上，而后加灭菌水至50ml。 （3）米粉：梗米粉经高压消毒或180℃干燥灭菌。 （4）配制50mmol邻苯二甲酸氢钾，pH6.3，高压灭菌。 （5）血清：56℃ 30min灭活，甚至未灭活的牛或马血清均可使用。 （6）R溶液贮存液：NaCl 50g (NH4) 2SO4 10g 柠檬酸.2H2O 20g MgSO4.7H2O 0.5g KH 2PO4 5g 乳酸(90%纯度) 4ml，加水至950ml，调节pH至7.0，最终调节容量至1000ml，分装高压灭菌，制备成贮存工作液。使用时将100ml贮存液加入850ml双蒸水，调节pH7.0分装高压灭菌。 （7）BR溶液：25ml R工作液与1个克隆的大肠杆菌，37℃振摇培养48小时。 （8）BRS溶液：在上述BR溶液中加入等量血清，继续培养24~48小时即可。 2．操作步骤 在含琼脂斜面的培养试管中加入10mg米粉、120ml红霉素液和足够遮盖斜面量的邻苯二甲酸氢钾和BRS液4:1混合液，加入少量(约50mg)粪便，混匀，37℃培养24小时后，移去培养上清液，加适量入4:1混合液并加入60ml红霉素和米粉。37℃继续培养48小时后，取米粉与粪渣混合物一滴，以碘液染色或直接观察有无滋养体；若未发现虫体再加入米粉，再培养24小时观察。若虫体阳性可将少量培养混合液转入新鲜培养基中继续培养，即为转种。 （二）无菌培养 最常用是BIS-33培养基，为液体培养基。培养在6ml的玻璃有盖培养管中，由于阿米巴为兼性厌氧代谢，故应紧盖管盖，并呈5°的角度放置。虫体对培养基和血清的要求甚高，甚至水质也会影响其生长，并非一般实验室可行。目前我国生产的培养基试剂尚不能成功培养虫体。BIS-33培养基含三个组分，即营养液、维生素混合液、成牛血清。 （1）营养液：K2HPO4 1.0g KH 2PO4 0.6g NaCl 2g L~半胱氨酸~HCl 1g 维生素C 0.2g 枸橼酸铁胺 22.8mg 葡萄糖 10g 消化蛋白胨，酵母提取物 30g 溶于600ml双蒸水中，调节pH至6.8，最终容量调至870ml，分装，高压消毒后，冷却至-20°贮存。 （2）维生素培养液 有多种，如下一种是最易配制的。 溶液A：烟酰胺45mg; 盐酸维生素B6 4mg; 泛酸钙 23mg; 盐酸硫胺 5mg; 维生素 B12 1.2mg，均溶于双蒸水，定容至25ml; 溶液B：核黄素7mg(加0.1N NaOH数微升使其易溶解)加双蒸水至45ml; 溶液C：叶酸5.5mg(加0.1N NaOH数微升使其易溶解) 加双蒸水至45ml; 溶液D：d-生物素2mg，加双蒸水至45ml; 溶液E：DL-6,8-硫辛酸1mg，溶于5ml 95%乙醇中，加入500mg Tween 80并定容至200ml，0.2mm滤膜过滤灭菌，4℃暗处保存。 （3）成牛血清 成牛血清需经4小时左右灭活方可用于培养，但需避免反复冻融。 （4）完全培养剂 营养液87ml，成牛血清10ml或15ml，维生素混合液2ml，混合，冷藏，随时可用。应用6ml的螺旋有盖培养管，36±0.5℃培养，72~96小时转种一次。可将向有菌培养的滋养体与37℃的BIS-33培养基混匀，使米粉等粗颗粒自然沉淀，取含滋养体的上清液通过滤纸，400g 2min离心，弃上清液。将含滋养体的沉淀溶入含青霉素、链霉素、卡那霉素、多粘菌素的BIS-33培养液中，并加入数滴福尔马林固定的短膜虫，在6ml螺旋有盖培养管中培养。24小时后可见滋养体贴附试管壁，换一次培养液，继续培养48小时或72小时后转种，使其逐渐转为无菌培养，并可进一步克隆化。 二、阴道毛滴虫培养 可分有菌培养和无菌培养。 1．有菌培养 主要是肝胨糖培养基。一般应用12