酶的化学修的饰.pptVIP

酶蛋白的化学修饰 概 念 酶的化学修饰（Chemical modification）化学手段将某些原子或化学基团结合到酶分子上，或将酶分子中某基团改变，改变酶的催化性质及一些生理生化性质。 易实现，作用快，成本 例如： 1、用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，对60°C热处理的稳定性增高了1000倍。 2、SOD、尿酸酶等用PEG修饰后，消除免疫原性，减慢在动物血液循环中被清除的速度 第一节 化学修饰的原理 由于酶分子结构的不规则、各原子间极性和电荷的不同、各个aa的相互作用等因素，会促使酶分子结构在局部形成一种微环境（极性、非极性），但直接影响酶活性部位aa残基的电离状态，酶分子微环境的改变 而当酶经过化学修饰后，减少由于内部平衡力被破坏而引起的酶分子伸展，大分子修饰剂本身为多聚电荷体，在酶分子表面形成一层缓冲外壳。 第二节 化学修饰的方法学 修饰试剂和修饰条件选择 1、试剂的选择 例如,对氨基的修饰有几种情况: ①修饰所有氨基,而不修饰其他基团; ②仅修饰α-氨基; ③修饰暴露的或反应性高的氨基 ④修饰具有催化活性的氨基等。 选择蛋白质修饰剂要考虑的问题: ①修饰反应要完成到什么程度; ②对个别氨基酸残基是否专一; ③在反应条件下,修饰反应有没有限度; ④修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变; 修饰试剂应具备以下特征: ①选择性地与一个氨基酸残基反应; ②酶蛋白不变性; ③标记的残基在肽中稳定 ④反应的程度能用简单的技术测定。 2、反应条件的选择 ①不造成蛋白质的不可逆变性。 ②有利于专一性修饰蛋白质。 3.?反应的专一性 ①利用蛋白质分子中某些基团的特殊性。 例：二异丙基氟磷酸酯(DFP)能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用,迅速导致酶失活。 位置专一性 ②选择不同的反应pH 蛋白质分子中各功能基的解离常数(pKa)是不同的。修饰的专一性 例如碘代乙酸可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的侧链及α-氨基、ε-氨基发生作用。 二、修饰程度和修饰部位的测定 1. 分析方法 用光谱法追踪检测：简便，实用，但要求修饰后 的衍生物具有独特的光谱或其光谱与修饰剂的不同 最常用间接法：蛋白质经降解和氨基酸分析后鉴定修饰部位。 2.化学修饰数据的分析 （1）化学修饰的时间进程分析 （2）确定必需基团的性质和数目 第三节 酶蛋白侧链的修饰 氨基、羧基、巯基、咪唑基、酚基、吲哚基、胍 基、甲硫基。 酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、 芳香环取代反应等类型 一、羧基的化学修饰 碳二亚胺 ? 二、氨基的化学修饰 氨基的烷基化 用三硝基苯磺酸（TNBS)修饰，在420nm 367nm PLP专一的赖氨酸修饰剂，反应形成希夫碱 再用硼氢化钠还原，325nm 酰基化 乙酸酐： 丹磺酰氯（DNS）： 还原烷基化 三、精氨酸胍基的修饰 具有两个临位羰基的化合物，丁二酮、1，2－环己二酮 四、巯基的化学修饰 5，5－二硫代－双（2－硝基苯甲酸） （DTMB,Ellman试剂）它与巯基反应形成二硫键，释放出1个阴离子，412nm 有机汞试剂，修饰产物250nm N－乙基马来酰亚胺300nm 烷基化试剂 （4）修饰巯基 二硫键交换，烷基化，酰基化，重金属化合物。 1）二硫键交换： E－SH + R－S－S－R E－S－S－R + R－SH E－SH + E－S－S－R E－S－S－E + R－SH 与—SH进行二硫键交换后，—SH被修饰，试剂的另一半以单体放出。 常用的二硫键交换试剂： DTNB， 5, 5’-dithio-bis-(2-Nitrobenzoate) 二硫二吡啶，4, 4’-dithiodipyridine （或2, 2’-dithiodipyridine） 2）重金属化合物： 对氯汞苯甲酸（PCMB） E－SH +