[染色方法总结.docVIP

染色方法总结 AgNOR染色法:1、试剂配制：（1）AgNOR染色液：甲液：明胶2 g 溶于双蒸水至99 ml，在60使之完全溶解，再加入纯甲酸1 ml 摇匀待用。乙液：硝酸银50 g 溶解于双蒸水中至100 ml，4冰箱保存。（2）AgNOR工作液取甲液10 ml，乙液20 ml 临用前混合。2、步骤：（1）切片脱蜡至水（2）双蒸水洗2次（3）AgNOR 工作液中（25）浸染30分钟（暗处进行）（镜下观察）（4）双蒸水洗3次（5）脱水,透明,封固 3、结果：油镜观察，细胞核及胞质背景为淡黄色， AgNOR呈棕黑色颗粒状。B鞭毛染色法:１．试剂配制：甲液：丹宁酸 ５克氯化铁（ＦｅＣｌ3） １．５克福尔马林（１５％） ２．０毫升氢氧化钠（ＮａＯＨ）１％ １．０毫升乙液：硝酸银（ＡｇＮＯ3） ２克蒸馏水 １００毫升制备乙液时，待硝酸银溶解后，取出１０毫升备用，向余下的９０毫升硝酸银液中滴加浓氢氧化铵，先呈很浓厚的沉淀，再继续滴加至刚刚溶解沉淀成澄清液为止。再将备用的硝酸银溶液慢慢逐滴加入澄清液中，先呈现薄雾，但轻摇则消失，继续边滴加边摇动，待澄清液呈现略有轻微不消散的薄雾状为止。如雾重，则银盐沉淀，不宜使用。２．染色方法：（１）将待检菌接种在新制备的肉汤琼脂斜面上，置３７°培养１６—２０小时，备用。（２）在载玻片的中部相隔一厘米处，用接种环各沾一滴蒸馏水，然后用接种环挑取湿润处的菌苔少许于一端的水滴中，倾斜玻片使培养物流至另一水滴中，两水滴自然相通，菌体从上位自然扩散到下位水滴中，待干燥后染色。（３）在干燥涂片上加甲液３—５分钟，用蒸馏水冲洗。将残水沥干或用乙液冲去残水后，加适量乙液保持３０—６０秒钟。染色时在酒精灯上稍加热，使染液出现蒸汽即可，用蒸馏水冲洗。（４）镜检：菌体及鞭毛皆染成茶色。３．注意事项：（１）染液最好随用随配，存放至次日效果则差。（２）一定要充分洗净甲液后再加乙液，否则背景较脏。（３）防止水及培养物沾有氯化物。（４）切忌用接种环涂抹培养物。（５）载玻片一定要洗净。先用洗衣粉煮沸，再水洗，干后放在洗液中，浸泡２４小时，取出水洗除去残酸，沥干，存放于９５％乙醇中备用。（６）加热时最好置金属板上，使载玻片受热均匀。概述：大肠杆菌的标志基因Lac Z编码β-半乳糖苷酶（?-galactosidase；?-gal），在其催化作用下，半乳糖可从乳糖的水解作用中得到。β-半乳糖苷酶非常稳定，对蛋白水解降解作用抗性强，且容易测试。因此β-半乳糖苷酶成为目前最常用的报告基因，以评价载体转染的效果。X-Gal （5-bromo-4-chloro-3-indoyl-?-D-Galactopyranoside） 是生物化学中常用的一种有机物，β-半乳糖苷酶可以将X-Gal转化为蓝色的产物，由此用它作为生色底物，来建立一种简单的目测颜色来确定原始组织β-半乳糖苷酶的活性，从而通过光学显微镜鉴别转染后组织细胞报告基因的存在与否和强弱表现。全组织（WHOLE MOUNT或EN BLOC）原位染色第一时间真实反应转染效果，组织形态维持良好，同时后续使用石蜡切片存档保存成为可能。 主要用途：全组织β-半乳糖苷酶原位染色试剂是一种旨在以X-Gal为底物，通过组织内表达的外源性细菌β-半乳糖苷酶的催化所生成的深蓝色的沉积产物，从而在光学显微镜下观察到蓝色表达的组织细胞分布，藉此建立一种简单的目测颜色来识别报告基因阳性组织细胞的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。广泛应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生物学研究。其适用于转基因后的人体和动物组织。产品即到即用，性能稳定，参数优化，着色敏感，堪称国际上同类产品最佳。 β－半乳糖苷酶可以催化二糖乳糖水解为单糖：葡萄糖和半乳糖。β－半乳糖苷酶的活性可以用X-gal（5-溴－4-氢－3－吲哚－β－D－半乳糖苷）等显色底物加以检测，β－半乳糖苷酶可将X-gal转变为不溶性的深蓝色沉淀。X-gal可以做为组织染色剂，可以在所有表达β－半乳糖苷酶的植物和动物组织上产生颜色。应该是可以用来病毒感染组织切片染色的。CCAE染色步骤1、试剂配制：（1）A液：萘酚-AS—D氯醋酸10mg溶于N,N-二甲基甲酰胺1ml中。（2）4％副品红液：取盐酸副品红(EM级)1g，溶于蒸馏水20ml内，再加入10m1／L的HCl 5m1，稍加温以增加溶解度，过滤、贮室温下。于使用前，取等量副品红液与新鲜的4％亚硝酸钠混合，之后用淀粉碘化物试纸测试，瞬间试纸应变为蓝色才合格，如果不变色，应加入更多的亚硝酸盐。（3）B液：o．1mol/L的Michaelis Veronal-醋酸缓冲液(PH 7.6)30m