课件9-管 式 凝 胶 等 电 聚 焦》[精选].ppt

《管 式 凝 胶 等 电 聚 焦》 1、实验原理： 每一种两性化合物例如蛋白质等都有一个等电点PI,当溶液的pH=PI时，该两性化合物所带的净电荷为零。PH ＞PI时两 性化合物带负电荷，反之两性化合物带正电荷。在电场的作用下，带正电荷的颗粒向负极移动，带负电荷的颗粒向正极移动。 当将两性化合物置于由两性载体所建立起来的pH梯度体系中进行电泳时，各种两性化合物就将分别聚集在相当其等电点的pH 位置,这即为等电点聚焦。 因为不同的两性化合物其等电点不同，因而可以达到分离的目的。在实验过程中，往往由于通电时产生的热量引起溶液的对流致使已分离的区带重新混合，因此在电泳中需要有抗电流的稳定介质，采用聚丙烯酰胺凝胶作为稳定介质的既称为凝胶等电聚焦，本实验采用圆盘电泳装置进行实验，因此亦称为管式凝胶等电聚焦。 聚丙烯酰胺凝胶有光聚合和化学聚合两种方法，本实验采取光聚合法。加样有在单体聚合后加样或是先将样品混合在单体配制溶液中，然后使单体聚合两种，本实验采用后一种。 在聚焦以后，通过对凝胶固定或光密度扫描的方法，将样品带显示出来，然后再与未经固定的参比凝胶管测出的pH梯度曲线比较，而对应出样品带所处的相当其等电点的pH值。 4、试剂与配制： 4-1、实验试 剂： （1）、考马斯亮兰—G 250 （2）、甲叉双丙烯酰胺 （Bis） （3）、牛血清白蛋白 （BSA） （4）、两性载体 (Amphaline pH 4-10） （5）、丙烯酰胺 （Acr） （6）、三氯醋酸 （TCA） （7）、乙二胺 （8）、核黄素 （9）、磷 酸 4-2、试剂的配制： （1）、丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）溶液的配制： 分别按表1.比例称取 丙烯酰胺（Acr），1.6克和甲叉双丙烯酰 胺（Bis）48毫克于25毫升小烧杯中，加蒸馏水10毫升，溶解即 可。 （2）、4%核黄素溶液的配制： 称取核黄素4毫克，加蒸馏水100毫升，溶解即可。 （3）、两性载体的配制： 直接取Amphaline 40%原液。 （4）、测试的样品溶液的配制： 称取牛血清白蛋白2.0毫克，加蒸馏水2.0毫升，溶解即可（浓度 为：mg/ml）。 （5）、5%磷酸溶液 [上电极槽溶液（正极）] 的配制： 吸取磷酸5毫升，加蒸馏水95 毫升，混匀即可（另还用作调PH 用）。 （6）、5%乙二胺溶液 [下电极槽溶液（负极）] 的配制： 吸取乙二胺溶液5毫升，加蒸馏水95 毫升，混匀即可。 （7）、凝胶固定溶液（15%TCA）的配制： 称取三氯醋酸15克，溶于100.0ml蒸馏水,混匀即可。 5、操作步骤： 5-1、凝胶系统的配制： 表1：凝胶系统溶液的配制方法表 （ 吸取量:3根管 / 组 ） 5-2、凝胶的聚合：（属光聚合法） 每组同学轮流排队加胶，不得各自分装以免浪费 （1）、将清洁、干燥的小玻管一端，用胶布贴封后，朝下 垂直放入有机玻璃凝胶玻管架的孔中，并在小玻管 的8.0 cm处作一记号。 （2）、用自动取液器（1000 ul）或注射器吸取上述配好 的凝胶溶液沿着小玻管内壁小心准确加入8.0 cm高。 （3）、凝胶加毕后，随即用注射器吸取蒸馏水，加至管中 的凝胶表面（1.0cm），使其表面覆盖一水层。 （4）、然后将凝胶管随支架一同移入日光灯箱内进行光聚 合约一小时。在聚合一开始，管中的界面渐至消 退，待胶体形成后，又将重新可辨（一般30分钟左 右即可），此时表明胶体已经凝聚。 5-3、聚 焦： 5-3-1、凝胶管的安装： （1）、取出并选择合适的聚合完毕的凝胶管，然 后弃去 凝胶管底端胶布，并倒去管端内的溶液。 （2）、用滴管分别吸取的上电极槽溶液和下电极槽溶液 洗涤凝胶管的上端和下端的凝胶表面。 （3）、将凝胶管的上端统一插在上电极槽底板的各同心 橡皮圈孔中（注意密封） 5-4、加电极溶液： 先用滴管吸取上电极槽溶液，在每凝胶管上端逐一加满，然后在 上、下两极槽内分别加入各自的上、下电极槽溶液。其用量，上电 泳槽以电极完全浸入为宜，