酵母蔗糖酶的纯化及性质研究[精选].doc

酵母蔗糖酶的纯化及性质研究酶的纯化实验原理蔗糖酶(E.C.3 2.1.26)能催化非还原性双糖(蔗糖)的1，2—糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。从式中可以看到，每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过Nelson 法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有的酶活力单位。啤酒醉母中含有丰富的蔗糖酶，本实验以它为原料，通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀柱层析等步骤提取蔗糖酶．并对其性质进行测定。除非特别说明，所有的纯化步骤均在0－4之间进行。(二)仪器和试剂试剂啤酒酵母、甲苯、95％乙醇、DEAE—纤维素、0.05mol/LTris 缓冲液，pH7.3。(三)操作方法1.取20g 干酵母或市售鲜啤酒酵母以2000rpm 离心10分钟后，所得的20克沉淀，加5一10g 细砂，加20m1甲苯，在研钵内磨成糊状。然后每次加10mL 水，研磨10分钟左右、共3次，使其呈糊状。2.将研磨好的内容物转移到50mL 离心管中，平衡后以12000rpm 离心15分钟。3.用吸管小心将离心后的中间水层转移到干净的离心管中，勿带上层甲苯相，然后以12000rpm 离心15分钟。4.将3步离心后的上清液取出，倒人量筒中记录其体积，留下1.5m1作为第一组分粗抽提液以备酶活力测定和蛋白浓度测定。5.用lmol/L 醋酸逐滴加进，调其pH 至5.0。6.将上述抽提液迅速放入到－50冰浴中，保温30分钟，在保温过程中经常缓慢摇动试管或搅拌抽提液。7.在冰浴中迅速冷却之，15000rpm 离心15分钟，弃去沉淀。量出上清液体积并记录之，留下2mL做为第二组分(热抽提液)以备酶活力和蛋白质浓度测定。8.在第二组分(热抽提液)中加入等体积的95％冷乙醇，保持低温(冰浴－20时间不少于30分钟)并温和搅拌，继续搅拌20分钟、然后以15000rpm 离心20分钟。小心弃去上清，沉淀沥干并用parafilm封口，保存于冰箱中供下面试验用。9.将沉淀溶解在6mL 的pH7.3 0.05mol/LTris-HCl 缓冲液中(第三组分，酒精抽提液)，搅拌使其完全溶解(5分钟以上)．以15000rpm 离心20分钟，弃去沉淀。上清液留下1.5mL 以备测定酶活力和蛋白质浓度。10.装DEAE—纤维素层折柱(2cm×20cm)，用0.05mol/LTris-HCl，pH7.3缓冲液平衡，约100mL流出液即可，以流出液pH 与缓冲液pH 一致为准。然后将第9步的酒精抽提液上柱，上样后用0.05mol/LTris—HCl，pH7.3缓冲掖进行NaCl 梯度(NaCl 为0－100mmol／L)洗脱，层析柱联上线性梯度混合器，混合器中分别装50mL，0.05mol/L，Tri s-HCl，pH7.3缓冲液和50mL 含100mol/L，NaCl 的0.08mol／L Tris- HCl，PH7.3缓冲液。洗脱至混合器中液体流完为止，测定各接收管在280nm 下的光吸收并测定各管的酶活力，将最高酶活力的若干管酶液集中，分装后低温保存，用于性质测定。留液(第四组分)测酶活和蛋白含量。酶促动力学研究(一)原理酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m 值等于酶促反应速度为最大速度的一半时所对应的底物浓度，其数值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的Km 值不同，同一种酶在与不同的底物反应时，其Km 值也不同。K m 值反映了酶和底物亲和能力的强弱程度，K m 越大表明酶与底物的亲和力越弱；K m 值越小，表明酶与底物的亲和力越强。酶的活力就是酶所催化的反应的能力，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定．但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。为了准确表示酶的反应速度通常采用初速度表示。酶活力可以被某些物质改变(激活或抑制)。凡能降低酶的活性甚至能使酶失活的物质，均称为抑制剂，其中又有可逆抑制和不可逆抑制类型。而可逆的抑制又包括有竞争性抑制、非竞争性抑制等类型。在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质会发生改变，如K m，Vmax 等。而酶的K m、Vmax 可通过作图法求得，其方法很多，最常用的就是双倒数作图法)。(二)试剂0. 2mL/L 乙酸缓冲液、0.5mol/L 蔗糖溶液、8mol/L 脲。(三)操作步骤1. Km 值的测定(1)时间作用曲线取试管编号，按下表顺序加入各种试剂，待测酶样稀释倍数按酶活力测定时的数据为准。注：表中试