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M13 Phage Display 901602 陳慧宇 前言： 　　蛋白質是目前公認在體內負責主要作用的分子單位，尤其是在DNA序列資料庫逐漸完整同時，我們更深刻體認到蛋白質表現的重要性及多樣性，不同的蛋白質之間對生物體也會造成不一樣的影響，即使相同的蛋白質在不同的細胞中，或是不同的環境之下，或是有不同的表現形式與結構，都會對生物體造成不一樣的影響，同時生物體內的其他分子，如糖類、脂質、DNA、各種離子……，也會對蛋白質之表現有所影響，或是在不同的蛋白質之間，彼此的交互作用之下，更顯複雜，要在生物體內，尤其是真核生物之中，看到單一蛋白質的作用，是非常困難的。 　　因此目前關於蛋白質的研究，最常用來表現蛋白質及觀察蛋白質作用的方法，就是yeast two hybrid以及phage display兩種。 　　前者是利用yeast的轉錄調控及蛋白質間的相互作用來進行有關蛋白質的選殖工作，如利用GAL4這個transcription activator具有兩個domain—DNA binding domain及activation domain，將這兩個domain的genes分別接上不同蛋白質的序列，包含一個是已知的蛋白質，另一個則是未知的希望篩選出來的蛋白質，再host中加上可篩選的基因，如使yeast變成是His-，並準備缺乏His的培養基，最後使兩個GAL4的domains能夠在yeast中表現，如果最後能夠在缺乏His的培養基中養出yeast，就代表了這個未知的蛋白質能和已知的蛋白質作用，也就是我們所希望選質出來的蛋白質。 　　而後者phage display則是利用把蛋白質表現在phage的外表上，然後利用這種攜帶了特定的蛋白質的phage，利用蛋白質彼此之間的交互作用去篩選所想要的其他蛋白質，例如，如果在phage表面接上antibody，就可以在固相的管子、plate……上固定會和其作用的antigen，來篩選出它的單株及多株抗體；而如果是在phage表面接上antigen，則目的相反，可以得到固定在固相的antibody所認得的epitope；如果在表面接上enzyme，也可以篩出其可作用的受質。篩選後的結果完全取決於所接於phage表面的蛋白質為何，phage display的基本目的是要在原來極多的目標中，將可能的範圍縮小到極小、甚至是一個目標，只要是符合此目的的都可以使用phage display的方法來篩選蛋白質，是一個很具有應用性的蛋白質篩選方法。 　　而我們實驗室所使用的就是phage display的方法，之後再進一步去篩選我們所需要的蛋白質以進行其他的實驗，而我這個暑假也就是藉phage display這個實驗題目，學習了許多相關的實驗技術。 實驗背景： 　　一般而言，phage display中可以使用的有很多，但是大多都是filamentous　phage，像是VCS-M13，M13KO7、M13mp19……等等，因為本身所帶有的genes很少，也知道表現proteins的具體功能，加上這種phage在感染bacteria時並不會造成他們的死亡，而只是減緩他們分裂生長的速度，所以想取出bacteria中的phage時只要挖取一部份的plaque即可；而我們實驗室所選擇使用的是M13 filamentous phage，是一種最wild type的filamentous phage。 　　M13 filamentous phage的長約1um，直徑小於10nm，是一種單股(single strand)環狀DNA的phage，大小約為6400 bp，只能infect具有pili的bacteria，所以通常會用E coli.來養M13 phage，現在也已經知道M13 phage共有10種蛋白質，標示為pI - pX，分別負責不同的功用。 　　和phage外表呈現有關的蛋白質有pIII、pVI、pVIII、pVII及pIX (圖一)。 圖一：M13 filamentous phage的外表結構圖。 pVIII是數量最多的，一個phage中有約2700個pVIII，其主要功能就是包住M13 phage的DNA；而其他四種蛋白質中，pIII及pVI在一端，pVII及pIX在另一端，這兩端分別是M13 phage進、出bacteria時所要用到的，四種蛋白質的數量在每個phage各為五個，而這些蛋白質在bacteria中translate出來後，就會跑到membrane上，待脫出時包裹ssDNA 。另外五個蛋白質中，pV是負責在bacteria中包裹ssDNA，到了要從bacteria離開時才會逐漸脫掉而換上pVIII為主要的packing protein；而pII及pX則是和pha