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青岛大学 硕士学位论文 内皮祖细胞在构建血管化组织工程骨中应用的实验研究 姓名：高振华 申请学位级别：硕士 专业：口腔临床医学（口腔颌面外科学） 指导教师：李宁毅  内皮祖细胞在构建组织工程骨中应用的实验研究 的影响。方法：抽取实验犬骨髓，密度梯度离心法获取单个核细胞，通过不同培 ??? ???，对??进行观察并采用乙酰化低密度脂蛋白??????、荆豆凝集 素??????荧光双标、流式细胞仪鉴定；制备犬同种异体脱钙骨基质 ??????? ??  ? ????? ?????? ??? ?? ??．????篣? ??????????? ? ????? ?? ??????? ?? ??? ? ?????????? ?????谢? ??產?狶?，??．??甀 ????? ?????????? ???瑃? ??????????? ?????? ?????? ? ?? ??? ???????? ????眂???????? ??? ????，?? ??? ? ???????? ?? ?????????；?????? ?????????? ?????? ?????????．?????：?? ??? ? ??? ?? ??????????? ??? ??? ??? ????? ?? ????????琫????? ? ??? ???篍????? ???  由各种原因造成的大节段和大范围的骨组织缺损在临床上经常见到，不仅影响 患者的功能也常常造成颜面和躯体的畸形从而影响美观和心理，其外形与功能的修 复也一直是临床治疗的目的。近年来，研究者探索了各种不同修复大型骨缺损的方法， 先后采用了自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植、人工骨替代用品等多种方 法，但上述方法各存在不足和限制之处。作为组织工程学一个重要分支，近年来骨组 织工程有关的研究较多，发展较快，在实验研究方面取得了一定的进展，作为骨缺损 修复治疗的方法之一显示出了良好的应用前景，然而目前的研究大多止步于实验室 内，其中重要的原因之一就是血管化的问题迟迟没有得到解决。国外学者研究发现， 植入体内的组织工程骨种子细胞只有在试验动物体内毛细血管周围很小距离内才能 通过营养的弥散而存活，因此构建体积有效血运良好的组织工程骨的根本方法就是 使植入物快速建立血运Ⅲ。因此，血管化问题是组织工程骨走向临床应用的瓶颈，成 骨区血管化的问题能否得到解决决定了组织工程骨是否可以走出基础研究从而走向 临床应用。 增殖能力差等。血管内皮祖细胞?????? ???珽??是在?? ????? ??的前体细胞，又称为血管母细胞。内皮祖细胞多存在于成人骨髓、胎儿肝脏、 外周血和脐带血中，研究中和临床应用时??的采集以骨髓和脐带血为主要来源， 因为二者中??相对丰富且增殖活性强于其它来源者。??不仅是胚胎期血管形 成的始动细胞，也是出生后血管形成的重要细胞?】。创伤、肿瘤、局部组织缺血、  青岛大学硕士学位论文 犬骨髓单个核细胞，通过不同培养方法获得??和经成骨诱导的骨髓间充质干细胞 ??? 体脱钙骨基质????????????，??，于体外复合??和经成骨诱 ?  ?? ??? ?? ?? ?。细胞培养箱 干燥仪 光学显微镜 ?  青岛大学硕士学位论文 ??培养基 纤维粘连素 ??、?? 北京芳草医药化工有限公司 ?  第一章材料与方法 硫酸镁 无水氯化锂 上海斯坦福生物制品发展有限公司 即可获取骨髓血来源的单个核细胞??．?。 ??．??内皮祖细胞的培养 以? ? ?  青岛大学硕士学位论文 ??．??骨髓基质干细胞的培养及成骨诱导 ??的鉴定 心后重悬于???苤校?直鸺尤隖??昙堑氖罂谷瓹??虲??流式抗体各? ? ???℃避光孵育?????清洗 两次，以?ザ嗑奂兹┕潭ê螅?匣??魇较赴?墙?屑觳獠⒎治鏊?檬?菖? ??．??细胞的荧光双染色鉴定 细胞培养至?天左右时，既可行乙酰化低密度脂蛋白??????和 ????—?荆豆凝集素??ü馊旧ǎ?獷???．?％胰蛋白酶消化后置于?孔板 ??％多聚甲醛固定???琍?漂洗，再加入?? 橙色细胞比例乜¨。 ??．???忠焯逋迅乒腔????的制备 ?  第一章材料与方法 一次盐酸。取出脱钙骨，??逑慈?椋?じ伤?趾螅?℃继续浸泡于配制的脱蛋白 ??疞 次液体，最后以??撼沟浊逑矗?涠掣稍锘?中?婵绽涠掣稍???票赋?．?? 化收集的??和???瓷鲜龇椒ń又种罥??上，分别于第?欤?天、?欤?魅〕? 块复合体以??％戊二醛固定???缓蠼ū瓯舅蜕?璧缇捣直鸸鄄觳⑸阆窦锹糂?? ?  青岛大学硕士学位论文 素，术后?拆线。分别于术后??、?周时各处死一组进行标本的进一步观察