ESRl 工IVS1-401 位点rSNP 的鉴定及其在慢性HBV 相关肝病中的意义.doc

ESR1 IVS1 - 401位点rSNP的鉴定及其在慢性HBV相关肝病中的wym417@163.com , 电话：023 背景：我们前期在群体水平和流行病学角度证实了ESR1基因外显子1 T29C多态性与慢性HBV感染及慢性HBV感染相关肝遗传关联T29C杂合子个体的ESR1 mRNA转录本中，两种等位的表达存在差异。阳性关联的T29C位点为同义SNP位点，其本身不具有功能意义。可能存在与外显子1 T29C位点连锁不平衡的调控区SNP（rSNP）位点，连锁不平衡分析和生物信息提示，ESR1内含子1 T-401位点与外显子1 T29C强烈连锁且存在核蛋白结合位点。鉴定此ESR1 T-401位点rSNP的功能，对揭示ESR1基因多态性在慢性HBV感染相关肝病中的作用具有积极意义。 方法：在我们收集的359名HBV感染相关急性肝衰竭HBV-ALF)患者，464名HBV感染相关肝硬化HBV-LC)患者和469例HBV感染无症状携带者组成的基于医院的病例-对照人群中，采用限制性片断长度多态性 (PCR-RFLP)和直接测序法对ESR1位点基因3个SNP（IVS T-401/C, T29C, A11940G）进行基因分型、连锁不平衡检测、单倍型分析和关联研究。综合采用荧光素酶报告基因试验、电泳移动漂移分析（EMSA）、单倍型等位特异性染色质免疫沉淀技术（HaploChIP）、位点特异性小RNA干扰（SiRNA）等手对阳性关联的ESR1 IVS1 -401T/C位点进行功能验证。 结果：HBV感染相关ALF患者病例组和HBV感染相关LC患者病例组中IVS1 -401/C和29C的等位频率显著高于HBV感染无症状携带者疾病对照组 (HBV-ALF vs AC：P = 3.7×10-4，HBV-LC vs AC：P = 2.1×10-5)。经非条件回归校正年龄、性别等因素后，在显性模式下，IVS1 T-401/C和T29C两个SNP位点与HBV相关急性肝衰竭以及HBV相关肝硬化显著关联。和IVS1 -401T/C或T/T基因型个体相比，IVS1 -401C/C基因型的个体对HBV相关急性肝衰竭以及HBV相关肝硬化易感性显著升高(显性模式；HBV-ALF vs AC：OR = 1.79, 95% CI = 1.54-2.12, P = 0.000；HBV-LC vs AC：OR = 2.07, 95% CI = 1.47-2.92, P = 0.000) 。功能实验在多个角度证实了与T29C位点连锁的IVS1 T-401C位点的可以通过结合核蛋白C-myb而发挥对ESR1表达的顺式调控作用；并且IVS1 T-401C位点的两个等位对核蛋白C-myb的结合能力存在差异，-401C等位对核蛋白C-myb的结合能力更强，表现出更强的增强子活性结论：IVS1 T-401/C和T29C两个SNP与HBV感染者发生急性肝衰竭关肝硬化。IVS1 401C等位可能通过影响了ESR1表达（mRNA和蛋白水平）而增加了HBV相关肝衰竭和肝硬化发病的危险因素。慢性HBV感染是遗传与环境因素相互作用的复杂疾病。近年来普遍认为宿主因素，尤其是宿主的遗传因素，在慢性HBV感染极其相关肝病的发病机制中起着极为关键的作用[2]，影响HBV感染和疾病进程的许多阶段[3]。探讨慢性HBV感染相关肝病的宿主遗传特征，将为我们从另一角度认识慢性HBV感染相关肝病及发病机制提供新的线索，并为临床防治提供新的、合理的策略，而以生物学功能相关基因作为候选基因进行病例-对照关联研究，是当前对复杂疾病进行遗传易感性研究的主要策略。ESR1在慢性HBV感染相关肝病的发生、发展及生存预后中均有重要作用，但其转录和表达存在显著的个体差异。顺式调控位点等位变异的功能影响是当前人类基因组研究的重要内容。本课题组前期研究从群体水平和流行病学角度已经证实了ESR1基因外显子1 T29C多态性与慢性HBV感染及HBV感染相关肝细胞癌的遗传关联。并且发现T29C杂合子个体的ESR1 mRNA转录本中，两种等位的表达存在差异，C等位的表达量显著高于T等位。但T29C位点为同义SNP位点(Ser/Ser)，其本身不具有功能意义。可能存在与外显子1 T29C位点连锁不平衡的调控区SNP(rSNP)位点。初步分析和前期实验提示与T29C高度连锁的内含子1 IVS1 -401T/C SNP位点是最可能影响转录调控的功能位点。鉴定IVS1 -401位点的顺式调控作用，观察C/T等位变异对ESR1启动子使用以及mRNA外显子缺失变异体产生的影响，对认识肝组织中ESR1表达调控个体差异的内在机制具有重要意义。本研究拟采用EMSA、荧光素酶报告基因试验(DLRA)、等位特异性染色质免疫沉淀(HaploChI