微生物分子生态报告讲诉.ppt

随机引物扩增多态性方法(RAPD) 随机扩增多态性DNA（Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD）?亦称随机引物PCR（Arbitrarily Primed PCR, AP-PCR），是Willam和Welsh于1990年建立的基因分型方法。该方法是建立在PCR基础上的新的检测基因组多态性的基因分型技术，它利用采用随机选择的单条或多条8-12mer引物经PCR扩增基因组DNA片段，然后通过凝胶电泳分析其DNA指纹图谱，其结果既表现种系发育过程的相互联系，也反映了不同克隆之间存在的差异，从而可鉴定不同菌株在基因水平上的差异。 变性梯度凝胶电泳与温度梯度凝胶电泳技术（DGGE/TGGE） 双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。 扩增片段长度多态性(AFLP) AFLP 是 RFLP 与PCR相结合的产物，其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组 DNA 产生不同大小的 DNA 片段，再使双链人工接头的酶切片段相边接，作为扩增反应的模板 DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加 1—3个选择性核苷酸作引物对模板 DNA 基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。 单链构象多态性 PCR技术(SSCD) 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.称该方法为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。在随后的研究中，科学家又 将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了 检测突变方法的简便性和灵敏性. 基本过程是: ①PCR扩增靶DNA; ②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子; ③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳; ④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果. 若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变. 末端限制性片段长度多态性 末端限制性片段长度多态性技术(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)是限制性片段长度多态性技术(RFLP)的扩展,它集RFLP、PCR和核酸电泳技术于一体[9210]。该方法依据微生物的比较基因组学信息,选取一段具有系统进化标记特征的DNA序列为目的分析序列,并据此设计出理想引物,用荧光物质标记出1个或2个引物的5′端(2个引物同时标记时,要用不同的荧光物质标记)。常用的荧光物质有四氯荧光素TET (52tetrachloro fluorescein) [11]、绿色的六氯荧光素HEX (52hexachloro 2fluorescein)[9]以及蓝色的六羧基荧光素62FAM 等。 扩增后的PCR产物用四碱基限制性内切酶进行消化,荧光标记末端片段可被测序仪识别,得到不同的末端片段峰,每一个峰就可至少代表一种类型的微生物,通常用系统分类操作单元(OTU)来表示。故根据片段峰的大小和数量可以检测和分析环境样品中微生物的末端限制性片段图谱,进而可分析出微生物群体的组成和动态变化等生态信息 新一代测序技术的应用现状 高通量测序技术 （High-throughput sequencin） 高通量测序技术堪称测序技术发展历程的一个里程碑，该技术可以对数百万个 DNA 分子进行同时测序。这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，因此也称其为深度测序 ( deep sequencing) 或 下一代测序技术( next generation sequencing， NGS) 2005 年，454 Life Sciences 公司( 现已被 Roche 公司