单克隆抗体的制备和应用-四川大学课程中心30__培训课件.ppt

①从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA； ②应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段； ③构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surface display antibody library)常用载体； ④表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。 构建噬菌体抗体库 模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆 建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA 通用引物具有人的种属普遍性 抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性 噬菌体抗体库特点 避开了人工免疫和杂交瘤技术 抗体库的大容量 抗体库极高的筛选效率 可获得高亲和力的人源化抗体 VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程 所用的抗体基因又来自人体 　第四节　单克隆抗体应用 诊断病原体 肿瘤的诊断 淋巴细胞表面标志物检测 检验医学 体外诊断试剂 标记免疫测定 肝炎病毒:HAV,HBV,HCV,HDV,HEV TORCH：弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒 ，单纯疱疹病毒 病原体测定 CD4/CD8:Th/Tc 白血病的分型 细胞表面CD测定 内分泌疾病的诊断 激素的测定 药物测定(TDM) 抗排斥药物 抗肿瘤药物 地高辛 越来越多未知功能cDNA的克隆 对复杂的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加 研究工作中的探针 免疫沉淀 干扰素的精制 物质的纯化 MACS 同位素标记McAb进行影像诊断 体内定位诊断 定义： 分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段 优点： 分子量小,穿透性强,抗原性低 不含Fc段，不会与带有Fc段受体的细胞结合，不良反应少 可在原核系统表达及易于基因工程操作 半衰期短，有利于及时中和及清除毒素 小分子抗体 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 细胞内抗体： 在细胞内表达 特异性识别某一基因产物 可干扰该基因产物的生物活性 研究基因结构与功能的关系 肿瘤的体内显像诊断 单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤组织中的分布指数较完整抗体分子高 放射显像时，放射性核素排除较快，对身体危害程度小，显像的本底较低 理想的显像定位诊断载体 病毒的诊断和抗病毒感染 血液性疾病的诊断 白血病的免疫诊断及分型 抗体融合蛋白 抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种分子相融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能 双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞 抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联，从而增强体内运输和药代动力学 体内免疫治疗应用 　自身红细胞凝集试验 快速检测HBV和HIV病原体等 　避免化学交联减低两者的活性，从而提高酶免疫检测的敏感度 用双特异抗体作为二抗，检测限达1ng／ml 双特异抗体应用 体外诊断 方法： 双特异抗体的一只臂结合靶抗原，一只臂结合半抗原螯合剂，后者可选择性地与放射性核素结合，利用二次导向系统显示 特点： 更高的的灵敏度和清晰度 体内肿瘤放射免疫显像 * * * 骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3) 50% PEG 1min内加完; 2min内加10ml培养液 融合方法 SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2-5 1ml 50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用 根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为0.5-1.5×105个。融合后7天，换用HT培养液。 细胞融合 10~20天出现克隆 HAT筛选 挑克隆 融合细胞的早期培养 可溶性抗原：ELISA抗体捕获法 细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞） 筛选常用方法 ELISA ELISA 多头加样枪 。 免疫荧光法 体外培养 中空纤维培养系统? 单抗含量不高，牛血清Ab难以去除 动物接种 每次用BALB/c或F1代小鼠，5-10 ╳105/只 生产单克隆抗体 细胞性抗原：1-2 × 107/只，不加佐剂，2-3周重复一次 可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3-6周 100-200微克抗原，融合前3天，加强免疫 免疫小鼠 腹腔注射法 前5天进行,预先腹腔注射pristane 1~5×106细胞 1~3w形成腹水 高滴度腹水 盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析 McAb的