细胞培养污染及排除__培训课件.pptVIP

使用培养液前，不宜较早开启瓶口，开瓶后的培养瓶应保持斜位，避免直立 不再使用的液体应立即封口 培养的细胞在处理之前不要过早的暴露空气中 操作时不要交谈、咳嗽，以防唾沫和呼出气流引发污染 操作完毕后应将工作台面整理好，并消毒擦拭工作面，关闭超净台。 4 其他预防： 主要有： 及早冻存培养物 重要的细胞株传代工作应有两个人独立进行 购入的未灭活血清一定要进行热灭活处理 为了避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统的抗生素，或尽可能不用抗生素 对新购入的细胞株应加强观察，防止外来的污染源 定期消毒培养箱。 污染的排除 良好的无菌操作是技术是控制微生物污染细胞的基础 细胞污染时，应首先找出污染的原因 如果有价值的细胞被污染，并且污染程度较轻，可以通过及时排除污染物，挽救细胞恢复正常。 常用的排除微生物污染的方法有以下几种： 1 抗生素排除法 2 加温除菌 3 与巨噬细胞共培养 1 抗生素排除法： 是细胞培养中处理细菌污染的主要手段。 抗生素的效用：抑菌、杀菌 提倡联合应用和预防性应用 发生微生物污染后再使用抗生素，常难以根除。 反复使用导致微生物耐药性的产生，而且对细胞本身也有一定影响 抗生素的冲击疗法 ---- 一些有价值的细胞被污染后，可采用5－10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24－48小时，再换入常规的培养液，有时可以奏效。 2 加温除菌： 是处理支原体污染的方法，因为支原体的耐热性能较差。 将受支原体污染的细胞置于41℃中作用5－10小时（最长可以达18小时）杀灭支原体。 3 与巨噬细胞共培养 原理：在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活7－10天，并可以分泌一些细胞因子支持其他细胞的克隆生长。与体内情况相似，巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化。 方法：利用96孔板将极少培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度地同时，更有效地发挥巨噬细胞清除污染地效能。 本法与抗生素联合应用效果更佳。 * 使用后开紫外灯灭菌，15min。使用前，打开风机，调节至中等到高等风速，处理15-30 min ,一方面去除臭氧，另一方面通过超净台过滤过的洁净空气流动，带走尘埃，使工作台内形成高洁净的工作环境。 * 如果培养物真的细菌污染，24小时内可以获得阳性结果。当污染的细菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时，大约每20分钟一代，会使培养系统中很快产生大量细菌，后者不仅可以消耗培养系统中的养分，还能释放大量代谢产物。几个小时后，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。 * * * * * * * * 但由于不易被察觉，有些污染的细胞仍在被应用。 据查，目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11%的细胞受到支原体污染。因此，对支原体的污染必须严加防范。 * 外观上给人以正常感觉，实则细胞受到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。 * * * 各种抗生素性质不同，对微生物作用也不同， * 但是41度对细胞本身应有较大影响，故在处理前，应先进行预试验，确定最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。 细胞培养（四） 暨 南 大 学 医 学 院 生物化学教研室 费 嘉 （一）培养细胞污染的判定与排除 污染的定义 ----按现代的观念，凡是混入培养环境中对细胞生存产生有害的成分和造成细胞不纯的异物都应该视为污染。 污染物的种类 微生物（真菌、细菌、病毒和支原体） 化学物质（影响细胞生存、非细胞所需的化学成分） 细胞（非同种的其他细胞） 污染途径 1 空气：空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。 ---- 培养设施不能设在通风场所。 ----- 无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩，以免因讲话、咳嗽等使外界污染进入操作面，造成污染。 超净工作台 2 器材：各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染，另外需要对培养箱进行定期消毒，防止形成污染 3 操作： 实验操作无菌观念不强 技术不熟练 使用污染的器皿或封瓶不严 培养两种以上细胞时，操作不规范，交叉使用吸管或培养液、培养瓶等导致细胞交叉污染。 4 血清：有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染。 5 组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造成碘混入组织、细胞或培养液中，影响细胞细胞生长。 污染对培养细胞的影响及污染的检测 ----体外培养细胞自身没有抗污染能力 ----培养基中抗生素抗污染能力有限 培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。 细胞污染早期或污染程度较轻时，如果能及时去除污染物，部分细胞有可能恢复 当污