第五讲核酸的分子杂交13.10.)解决方案.pptVIP

Western blot 原理： western blot 结果： western blot 九、荧光原位杂交（FISH）技术及其在医学上的应用 荧光原位杂交 (Fluorescence in situ hybridization , FISH) 是一种在放射性原位杂交基础上发展起来的非放射性原位杂交技术，是把生物素或地高辛(DIG)等标记物质标记的DNA片段作为探针（probe），与染色体DNA进行分子杂交，利用荧光色素为检测信号，在荧光显微镜下直接检测探针互补的DNA片段的存在部位。 实际上是分子生物学与细胞生物学交叉结合而形成的一种现代生物技术，属于分子细胞生物学的范畴。 FISH技术现已成为分子生物学与分子细胞遗传学研究中的重要手段。 （二）FISH的基本原理 依据碱基互补原理，将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记（如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP），然后将标记探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再通过直接检测（荧光素直接标记的探针）或用荧光素分子藕联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来间接检测DNA在染色体或DNA纤维上的定位。 FISH基于免疫组织化学（抗原抗体反应，即与荧光素偶联的抗体和抗原结合）与分子杂交原理。 （三）用于FISH的探针类型 a. 着丝粒探针(centromeric probe) b. 全染色体或染色体区带特异性探针 (whole chromosome or region-specific probe) c. 染色体特异性单一序列探针（unique sequence probe ，USP） d. 端粒染色体探针(telomeric chromosome probes 探针DNA 染色体标本 切口平移法 前处理 探针DNA变性 染色体DNA变性 单链DNA 单链DNA 用PI、DAPI对染色体染色 （四）荧光原位杂交（FISH）示意图 探针DNA与染色体DNA分子杂交 用抗生物素蛋白—荧光素处理 找出杂交信号 用荧光显微镜观察 生物素（地高辛）标记 （五）FISH衍生技术 随着分子生物学实验技术的不断发展,FISH技术也在不断发展，已形成了一系列衍生技术: 1. 染色体涂染(chromosomal painting)技术 2.多彩色荧光原位杂交(multicolor-FISH) 又称多色涂染技术(multiplex-FISH ) 双色FISH图 双色FISH图 Northern印迹杂交是指将待测RNA样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行固—液相杂交，以检测RNA（主要是mRNA）的方法。其基本原理和基本过程与Southern印迹杂交基本相同。只是在以下几点有所不同。 （二）Northern印迹杂交 1. 靶核酸——RNA 2. RNA电泳——在变性胶中进行（加入变性剂，以维持单 链线性状态） 3. 转膜——电泳后不需要再进行变性和中和，直接用毛 细管虹吸法等方法转移。 （三）斑点及狭缝印迹杂交 特点：简单、快速，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测； 但不能鉴别分子量，且特异性不高，有一定比例的假阳性。 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维膜和尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为斑点印迹(dot blot)。 如印迹是线状则为狭缝印迹或狭线印迹(slot blot） （四）原位杂交 核酸保持在细胞或组织样本中，经适当的方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交（in situ hybridization）。 这是一种标记DNA与整个染色体杂交并且发生杂交的区域可通过显微镜观察的技术。 特点： （1）不受组织成分的影响；（2）灵敏度高；（3）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系及功能；（4）可检测多个探针。 核酸原位杂交包括组织细胞的固定、预杂交、杂交、冲洗及信号检测等基本步骤。 1. 组织或细胞的固定 2. 组织细胞杂交前的预处理（预杂交） 3. 探针的选择和标记 4. 杂交 5. 杂交结果检测 重点介绍荧光原位杂交 （fluorescence in situ hybridization,FISH） 概念：液相杂交是指待测核酸分子与核酸探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子。 种类： A. RNA酶保护分析法(RNase protection assay, RPA) 用于mRNA定量、mRNA末端定位及确定内含子在相应基因中的位置等。 （五）