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反相HPLC中的溶剂优化 MeOH,ACN,THF似乎可以满足反相HPLC要求： 容易样品：ACN/水 一般样品：MeOH/水 THF/水 困难样品：多员梯度 优化反相HPLC步骤 1选择标准梯度条件进行首次实验 乙腈/水5－100％25min,2ml/min或 乙腈/水5－100％50min,1ml/min 2 调整梯度范围，尽可能减少色谱图开始和结束时的时间浪费 3 如果色谱峰复杂，分离较差： 延长梯度时间 加长柱长 使用细粒度的柱 降低流速以提高塔板数 4 一旦色谱图中能容纳所用峰，改变流 速以调整峰间距 5 需要进一步改变谱峰间距，改变有机溶剂 重现性好的分离 色谱平衡 通常情况下，柱子用15～20柱体积的起始流动相充分冲洗后方可达到柱平衡。柱再生所需时间通常约等于梯度时间。 基线问题 等梯度HPLC 等梯度反相分离 保证柱寿命和性能的步骤 1 选择好填充柱 2 减小压力波动，避免冲撞击 3 用保护柱和在线过滤片 4 经常用强溶剂冲洗柱子：反相用1:1的异丙醇/氯仿，正相用甲醇 5 样品预处理，尽量减少无谓的强滞留成分和微粒 6 用较柔和的pH值3－7 ；防止键和相的流失 7 储存时冲洗掉盐缓冲液，以纯乙腈保存柱， 避免高浓度的水和醇类 浅谈RP-HPLC方法的建立 蒋 辉 防化研究院生物有机实验室 浅谈RP-HPLC方法的建立