2.FCM分析和分选原理幻灯片.pptVIP

流式细胞仪的构造和工作原理(Components and principle of Flow Cytometer) 细胞的分选技术 狭缝扫描流式细胞仪 ?.ELITE ESP型，该型仪器是一大型的功能较强的FCM仪器，分选功能强大，分选速度最高可达15000个细胞/ 秒，可配置多种型号的激光器。在光学系统值得一提是在检测聚透镜的对面加有一反射镜，这将提高检测光的灵敏度。另一个特点该机型在荧光屏上可直接观察分选时的液滴形成过程，这一点为该公司首创使用。 2.Beckman-Coulter公司，是多年来销售血球计数器的厂家，目前两种型号的流式细胞仪。 ? EPICS XL型，是COULTER公司生产的一种临床型的仪器，该仪器的特点是应用于488nm光束就可激发四色荧光的检测，这是该公司开发的一项专利技术，并主机与计算机由光纤联接，数据传送过程中丢失少，这也该机型的特点。 * * 概述 流式细胞仪(Flow cytometer,FCM)是一项集激光技术·电子物理技术·光电测量技术·计算机技术以及细胞生物化学技术·单克隆抗体技术于一体的高科技仪器。随着各种相关技术的进展，流式细胞仪已日益完善，成为细胞分析和分选的有力工具。 流式细胞术的基本概念 使制备合格的单细胞悬液高速流过一个光学或电子传导特别敏感区，产生一组光学和电子信号，这些信号代表着重要的生物学性质，并进行定量分析。 流式细胞术应用于生物医学应包括下列步骤： 1.制备合格的单细胞悬液。 2.对所研究的细胞生物化学成分进行特异性荧光染色或标记，但对于单独光散射测量则不需染色。 3.流式细胞仪测定制备好的细胞悬液样品。 4.进行定量分析，所测数据一般用计算机自动化程序辅助分析。 5.对定量分析的结果，进行解释其在生物学方面意义。 流式细胞仪分为两大类： 一类为台式机型：其特点为光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握，又称为临床型仪器。 另一类为大型机：其特点为可将实验者所感兴趣的细胞分选出来，并可将单个细胞或特定的细胞数分选到培养孔和板上，同时可选配多激光光源和多个波长光束，适用于更广泛更灵活的科学研究应用，这类FCM仪器又称为科研型流式细胞仪，这类仪器操作复杂，价格昂贵， 适用于科研单位。 也有分为3类的:台式机、大型机、新型流式细胞仪。 流式细胞仪的结构 流式细胞仪的构造一般分为六部分： 1.流动室及液流驱动系统。 2.激光光源及光束形成系统。 3.光学系统。 4.信号检测系统。 5.数据储存.显示和分析系统。 6.细胞分选系统。 流式细胞术的基本工作原理 流式细胞术是一种对悬液中的单个细胞或细胞器粒子等进行快速测量并自动化分析的高新技术，该项技术国际上把它归入分析细胞学专业领域。该技术的功能主要有定量分析和分选。 *定量分析的基本原理 *分选技术的基本原理 见FCM结构示意图 工作原理????? 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过? A／D转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数?目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，? 既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流? 断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废