酶联免疫技术的发展与进展__培训课件.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 捕获法原理 + - E E E E E 1、固相化抗人 　IgM 1、固相化抗人 　IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合 4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色 2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合 3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合 4、加酶标抗体 无抗原结合， 加底物不显色 * * YHLO专业培训 六、酶联免疫分析技术的设备 1、加样器 2、洗板机 3、孵育箱 4、加速仪 5、酶免分析仪 6、数据分析方法 7、结果报告系统 * * YHLO专业培训 七、酶联分析所需使用的材料 ? （ 1）抗原：纯化抗原、合成抗原、基因工程抗原。 （ 2）抗体：多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体。 （ 3）酶标抗体或抗原：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、 B-半乳糖苷 酶等。 （ 4）酶色原底物：邻苯二胺（OPD）、ABTS、四甲基联苯胺 （TMB）；对硝基苯磷酸盐（pNPP）,酶发光底物（鲁米诺、 AMPPD）。 （ 5）微孔反应板 （ 6）洗涤液、终止剂 （7）阳性质控品 （8）阴性质控品 * * YHLO专业培训 标记酶的要求： 活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 （一）酶和酶作用底物 * * YHLO专业培训 辣根过氧化物酶（HRP） 糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 RZ值：403nm （辅基）　　　与275nm（主酶） 　　　OD值之比 RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要 ELISA中应用最为广泛的标记用酶 常用酶 酶和酶作用底物 * * YHLO专业培训 碱性磷酸酶（AP） 菌源性AP 肠粘膜AP β–半乳糖苷酶（β-Gal） 用于均相酶 免疫测定 常用酶 酶和酶作用底物 * * YHLO专业培训 HRP的底物 DH2+H2O2→ → → D+2H2O HRP 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种 H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高 常用底物 酶和酶作用底物 * * YHLO专业培训 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。 　HRP的常见底物 酶和酶作用底物 * * YHLO专业培训 AP的 底物 β-Gal 的底物 对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ） 4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（ 4MUG ） 经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。 酶作用后，生成高强度荧光物 ，用荧光计 测量。 常用底物 酶和酶作用底物 * * YHLO专业培训 酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（conjugate） 酶标记物 通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物 （二）酶标记抗体或抗原 * * YHLO专业培训 抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。 制备方法要求 酶标记抗体或抗原 * * YHLO专业培训 制备方法要求 技术方法简单、产率高，重复性好 标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性 酶标记物稳定，不形成聚合物 酶标记抗体或抗原 * * YHLO专业培训 制备方法 过碘酸钠法（直接法） 常用于HRP标记抗体或抗原 戊二醛交联法 酶标记抗体或抗原 * * YHLO专业培训 戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记