蛋白质的提取幻灯片.ppt

第四章 生物化学与分子生物学技术实践 第一节 生物成分的分离与测定技术 蛋白质的分离与纯化 蛋白质的性质 蛋白质分离和纯化 蛋白质的分离步骤 蛋白质的纯化方法 蛋白质含量的测定 蛋白质纯度等的测定 一、蛋白质的性质 蛋白质存在于生物体的组织细胞中，不同的生物体组织细胞所含的蛋白质种类、数量也不尽相同。 1 、蛋白质的两性离解和电泳现象 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳。 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性。 蛋白质的变性 变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 要研究某种蛋白质的结构、性质和功能，就必须将这种蛋白质从组织细胞中分离、纯化出来。因此，蛋白质的分离与纯化技术便成为蛋白质研究的重要技术。 研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。 (1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞； (2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。 (3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。 (1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法和酶解法等。 (2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液（透析液）抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用有机溶剂抽提等。 (3)粗提: 离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 (4)提纯：可用层析法、电泳法等进行提纯。 (5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。 离心沉降法 凝胶色谱法 萃取法 层析法 电泳法 【实验原理】 1.电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，它们的电泳迁移率不同。 【实验原理】 2. 影响电泳的因素： 内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状 外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 3.醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点 血清蛋白参考值 4. 经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。 【实验器材】 1. DYY-6C型 ?双稳定时电泳仪和DYY-Ⅲ型电泳槽 2.醋酸纤维薄膜（2 cm×8cm）：1片/人。 3.培养皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。 4.点样器：载玻片。 5.滤纸：公用。 6.镊子：一个/组。 【实验试