(本科生六个基本生物学实验.docVIP

实验一：感受态细胞的制备 1.　原理： 当实验室获得了一个新的质粒时，而这个质粒并未转化到宿主菌体内，则需要该技术进行细菌的转化，以大量获得这一质粒。转化细菌的方式有很多种，如电转化法、脂质体转染法、显微注射法、CaCl2处理法制备感受态细胞等。一般的实验室都应用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可在抗菌素培养基上生长形成菌落。这一方法是分子生物学常用实验方法。 2.　实验材料 2.1　LB液体培养基 2.2　0.1mol/L CaCl2溶液：称取1.1g无水CaCl2，溶于90ml双蒸去离子水中，定容至100ml，用0.22μm滤器过滤并装入灭菌试剂瓶中，4℃保存。 2.3 DH5α菌株，冰，牙签，无菌滤纸，50ml离心管，枪头（以上需灭菌）；移液器，摇床，冷冻离心机，涡旋震荡器，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，普通冰箱，-70℃冰箱 3.　操作方法 3.1　从37℃培养12—16h的平板上，用无菌牙签挑取一个单菌落，转移到含有3ml LB培养基的试管内，37℃振摇过夜。次日取菌液1ml，接种到含有100ml LB培养基的500 ml烧瓶中，37℃剧烈振摇培养约2—3h（振摇速度为200—300r/min），待OD600值达到0.3—0.4时，将烧瓶取出立即置冰浴10—15min。 3.2　自该步骤起皆需无菌操作。在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理过的、冰预冷的50 ml离心管中。 3.3　4℃离心，4000g×5min回收细胞。 3.4　弃去培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。 3.5　加入冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液10ml重悬菌体，置冰浴30min。 3.6　4℃离心，4000g×5min,弃去上清液，倒置于滤纸1min。 3.7　再加4ml用冰预冷的0.1mol CaCl2重悬菌体（重悬时操作要轻）。 3.8　置4℃冰箱置12—24h，即可应用于转化。 思考题： 制备感受态细胞时加入CaCl2的作用是什么？ 钙离子结合于细胞膜上，使细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，细胞膜的通透性发生变化，使外源DNA进入。 实验二 质粒转化 原理　 当宿主菌接受CaCl2处理后，细胞膜通透性改变，感染细菌的质粒很容易地透过细胞膜，在宿主菌酶系统的作用下，质粒大量繁殖。通过进一步实验，可获得大量的质粒DNA，以供分子生物学实验所用。一般的实验室都应用CaCl2处理细菌。 2. 实验材料 2.1，质粒GFP-SNAT2-pBK-CMVΔ （kan抗性） 2.2，LB固体培养基平板 (kan抗性)，LB液体培养基 2.3，感受态细胞 2.4， 1.5ml离心管，枪头，三角耙（以上物品需灭菌处理）；移液器，冰，恒温水浴锅，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，-70℃冰箱 3.　操作方法 3.1　无菌状态下取新鲜感受态50μl置于无菌的1.5ml离心管。 3.2　每管加质粒50—100ng，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。 3.3　42℃热休克90s，不要摇动离心管。 3.4　每管加无抗生素的普通LB培养基950μl，37℃(150—180r/min)摇床，温和摇振45min。 3.5 用无菌弯头玻璃铺菌器（三角耙），将10μl菌液铺于含卡那青霉素(Kan)的琼脂平板表面，37℃平放20min，然后倒置培养10—14h。 4.结果观察 计数全皿菌落数 5.写实验报告（详细描述转化菌落的生长情况） 6.思考题 请说明每一步骤的原理：冰上30分钟、42度热休克90秒、37度温和震荡45分钟等。 冰上30分钟：转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。 42度热休克90秒：42度短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随即出现许多间隙，促进细胞吸收DNA复合物。 37度温和震荡45分钟：促使在转化过程中获得新的表型得到表达 实验三 质粒DNA的抽提和纯化 1.原理： 质粒为多数细菌和某些真核生物染色体的双链环状分子。一般情况下，质粒并不是它的宿主细胞所必需的，如细胞分裂时，分裂的子细胞中不含质粒，但子细胞仍能生长分裂。然而，许多质粒含有在特殊环境下所必需的抗生素抗性。尽管质粒的复制有赖于宿主细胞的酶系统进行，但质粒DNA是独立于宿主基因组以外的环状分子，对于碱的裂解具有较强的耐受性，因此，用碱裂解法可将质粒DNA与宿主的线性DNA分开。 2材料 2.1质粒DNA小抽试剂盒，乙醇 2.2含质粒的菌液（GFP-SNAT2-pBK-CMV⊿） 2.3 离心管，枪头（以上物品需灭菌）；移液器，离心机