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细胞的传代培养 本次课内容 复习细胞原代培养基本知识 细胞生长的规律 重点：细胞传代培养的操作过程 操作：HepG-2细胞的传代 原代培养 什么是原代培养？主要分哪几种类型？ 胰酶消化法的主要操作过程。 消化培养法的主要过程 细胞传代培养 概念：培养的细胞由于细胞增殖，数量增加，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，将培养的细胞分散，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养，也叫做继代培养 一般细胞可传代10-50代。 所谓细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次。 （一）潜伏期（Latent phase）： 细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。 二倍体细胞该期时间长（24-96h） 连续细胞系时间短（10-30min） （二）指数生长期： 细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。 体外培养细胞分裂指数介于0.1-0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。 指数生长期是细胞活力最好的时期，可对细胞进行各种实验 指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则无接触抑制现象。 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制 （三）停滞期： 即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。 在此时应及时进行传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。 细胞的传代培养操作 1、悬浮细胞 可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用离心法后，加入新培养基后再吹打分散进行传代 2、贴壁细胞（重点） 贴壁细胞传代培养过程 1、实验准备：细胞培养用的器材灭菌、超净工作台准备、实际预温、操作人员准备。 2、倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。 3、加入2滴管0.25％胰蛋白酶消化液，消化2～3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。 4、加入1～2滴管含有血清的培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。 5、以1：2或1：3进行分装，补充新鲜培养基，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃CO2培养箱培养。 6、观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。 注意事项 1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。 2．传代时间的掌握：每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 3、消化时间的掌握 思考题 1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤? 2.细胞胞传代培养的目的是什么? 3.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同? 4.如何估计是否传代和传代的方式? * * 贴壁细胞的生长规律 贴壁过程 培养细胞一代生长过程 刚加入 合适 过头 * * * 一代中，细胞一般分裂3-6次左右。 又叫游离期