FLT- singaling in macrophages promotes glioma growth in vivo - 副本.docVIP

巨噬细胞内血管内皮因子受体—1促进神经胶质瘤细胞生长 马克?科博，伊冯?瑞思，安克?威客等 1 肿瘤血管生成的研究小组,神经外科、弗莱堡大学弗莱堡,德国; 2 神经病学研究所 德国法兰克福,法兰克福大学埃丁格研究所; 3 部门在放射医学物理学,初级组分子 成像,德国癌症研究中心、海德堡、德国; 4 Max-Planck实验心脏病学系研究所 心脏和肺部研究德国; 5 心脏病和心血管研究所马斯特里赫特, 荷兰马斯特里赫特; 6 大学遗传学系研究所MedicalScience东京,东京,日本 一些研究显示,Flt-1及其可溶性形式可能充当诱饵受体捕VEGF-AFlt-1信号支持病理性血管生成的作用已被证明在发生、转移、炎症性疾病在脑部肿瘤,如患,巨噬细胞/小神经胶质细胞渗透中发现丰富的肿瘤大量的证据表明,巨噬细胞和小胶质细胞也具备执行任务,这将有助于神经胶质瘤更多的入侵和进一步发展,支持肿瘤血管生成细胞系,质粒构建、细胞转染 GP + E86 virus-producing细胞细胞在DMEM培养补充FCS为10%。 Gl261-VEGF一直先前描述的生成(26)。为 代Gl261-PlGF,人类PlGF-2全长cDNA插入 成一个全retroviralvector用于稳定使转染GP + E86病毒- 生产的细胞。子转染细胞被选1毫克/毫升 新霉素模拟G418。High-titer逆转录病毒感染 Gl261小鼠神经胶质瘤细胞如前所述(26)。G418-resistant 表达的克隆筛选PlGF基于 免疫印迹分析。逆转录病毒上清表达空满 向量用于生成Gl261-empty向量。G418-resistant克隆是 检查pcr技术对新霉素的表达式 基因。没有观察到的主要区别在体外细胞增殖 在Gl261、Gl261-empty-vector Gl261-VEGF,Gl261-PlGF。 RNA隔离 从肿瘤样本进行RNA提取两个步骤:冻结 肿瘤样本均质1毫升PeqGold RNA纯试剂 (PeqLab生物技术)。接下来,200 AL氯仿被添加到 均质样品和centrifuged(12000克,15分钟和4 jc)。的 产生的水上层清液与异丙醇,1卷 centrifuged(12000 g,10分钟,4 jc)。在这一步中,颗粒 resuspended 350年阿尔RTL缓冲区使用试剂盒,进一步纯化 RNA迷你包(Rneasy totalkit试剂盒)根据制造商的 指令。每个样本的浓度从A260中获得 测量。RNA gelelectrophoresis完整性测试。 逆转录和实时PCR 一微克(1 Ag)从肿瘤totalRNA反向转录 使用RT2第一链工具包(Superarray生物科学公司)根据 制造商的过程。该工具包包含一个程序来消除 污染基因组DNA与RNA逆转录之前样品。 鼠标SDF-1(CXCL12)Taqman化验(Mm0044552-m1 Taqman基因 表达分析,应用生物系统公司),认识到三个亚型 鼠标SDF-1(参考序列NM001012477.1 NM013655.3 NM021704.2扩增子长度122),用于本研究。实时PCR进行光学多井板384使用一式三份 光周期计480探针大师(罗氏应用科学)。为每个20艾尔 Taqman反应,2 AL cDNA样本(1:10稀释,1:10 相应的cDNA大约10到1 ng RNA, 分别)与反应溶液混合(18)组成的 1 AL primer-probe混合10 AL 2光周期计480调查的主人,和7的 水,PCR等级。内生控制、并行为每个样本化验 使用引物和探针h-actin(Ms1) 和鼠标phosphoglycerokinase(PGK-1;Mm1;应用 生物系统)。消极的控制进行了水和RNA 反转录。480年一个LightCycler反应进行 系统(罗氏应用科学)使用以下参数:预孵化95 jc 5分钟,放大45周期(95 jc 10年代,60 jc 30年代)。 标准曲线的制备使用四个稀释的代表肿瘤 探测已知表达大量的SDF-1 SDF-1准备, h-actin,PGK-1。相对mRNA水平(任意单元)的SDF-1两个 不同的探测器每组(mock-transfected VEGF-overexpressing肿瘤 和PlGF-overexpressing肿瘤)规范化h-actin和PGK-1。 诺慎印迹分析 5到10 Ag)的RNA electrophoresed在1.5%琼脂糖凝胶 含有15%甲醛和随后转移到Duralon在10 SSC膜(Stratagene)。过滤和紫外线交联 (0.4 J /厘米2)和杂化在68年杂交的解决方案(jc