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液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 色谱起源 色谱分离的机理 色谱法分类 按两相的物理状态分：气相色谱法(GC)、 液相色谱法(LC)和超临界流体色谱法(SFC) 。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。超临界流体色谱法以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。 按原理分：吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛) 、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法,此外还有电泳。 按操作形式分：纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法 HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压：压力可达150～300Kg/cm2。 高速：流速为0.1 ～ 10.0 mL/min。 高效：可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度：紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快：通常分析一个样品在15 ～ 30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 分辨率高：可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高：紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg 柱子可反复使用：用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 什么是高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是利用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，按照固液相之间的分配机理对混合物进行分离测定的色谱方法。 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业…… 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段 HPLC在药学中的应用 含量测定（最普遍应用） 还包括有关物质检测，杂质/有害物质限量检测。 指纹图谱检测 主要用于中药注射剂。 鉴别 与薄层鉴别类似，被测物质与对照品具有相同保留时间相当于具有相同Rf值，即初步认为同一物质。 纯度检测 通常用面积归一化法检测对照品纯度。 分离纯化样品或制备对照品（仅限制备型色谱） HPLC的仪器配置 P680A色谱泵前面板 P680A LPG流路图 P680 HPG流路图 六通阀 结构 六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。 工作原理 手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出； 将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。 六通阀进样演示 单击NEXT播放 色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram） 液相色谱图相关术语 色谱峰 － Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线 峰底 －