(蛋白质化学实验报告.docVIP

实验一 低温豆粕提取大豆分离蛋白 原理 大豆分离蛋白的提取是根据大豆中所含的蛋白质在不同的pH时有不同的溶解度的特性而实现的。大豆粕中所含的蛋白质大部分都能溶解在水中，在pH6.5的蒸馏水中有很高的溶解度，且都能溶解于0.2%的碱液中，相反，在pH4.5时，蛋白质的溶解度非常小。所以大豆分离蛋白的提取是先用水或稀碱液从低温豆粕中萃取可溶物，用离心机分离出不溶物（豆粕渣）然后在萃取液（豆乳）中加酸（盐酸、磷酸、醋酸等）调节pH到4.2-4.5，于是蛋白质即从萃取液中沉淀出来，倾除清夜（即乳清、主要是低分子糖类、蛋白质等），将下层的蛋白质凝聚物进行水洗、浓缩、干燥即可得到等电点分离蛋白。 试剂及仪器 1）氢氧化钠 AR级 2）盐酸 AR级 3）电热恒温水浴锅 4）电热恒温干燥箱 5）离心沉淀机 6）酸度计 7）多功能电动搅拌器 三、实验步骤 在1000ml烧杯中将50克豆粕按料液比1：10的比例与水混合，温度50℃，低速搅拌30-35rpm，用1N氢氧化钠pH调至7.5，继续搅拌30分钟。悬浮液在2000 rpm转速下离心15分钟，回收上清液，沉淀（豆渣）弃去。上清液边搅拌边加入1NHCl（30-35rpm），将pH调至4.5，温度30℃，继续搅拌10分钟。将悬浮液在2000 rpm离心15分钟，弃去上清液（大豆乳清），回收沉淀（凝乳）并称重。 称取5克（精确到0.001克）于表面皿中，在105℃烘箱内烘干至恒重，测定凝乳的水分含量，烘干后的凝乳存放于干燥器内保藏。其余湿凝乳置于-15℃下冷冻储藏备用。 习题 1.求凝乳分离蛋白产品的含水量、蛋白含量 2.求分离蛋白生产过程的提取率、蛋白回收率、蛋白纯度一般是多少 3.为了提高蛋白提取率，在萃取、浆渣分离等操作中可采取什么措施？ 实验二 凯氏定氮法测定大豆分离蛋白中蛋白质的含量 一、原理 浓硫酸和样品及催化剂一起加热沸腾，样品中蛋白质分解，其含的N 变成（NH4）2SO4,碱化并蒸馏使NH3放出，将NH3蒸入酸溶液，在以标准酸来滴定，测得样品中的含氮量，从而得出样品中蛋白质含量，其反应式如下： 二、仪器 1）万分之一分析天平 2）饱和氢氧化钠溶液 3）2%硼酸溶液 4）溴甲酚绿-甲基红混合指示剂 5）催化剂：CuSO4?5H2O―K2SO4（1：10） 式中：―滴定试样时消耗标准盐酸的体积（ml） ―滴定空白时消耗标准盐酸的体积（ml） N―标准盐酸的当量浓度 6.25―将氮换算成粗蛋白质的系数 0.014―每毫克当量氮的克数 W―M―试样水分含量 平行测定的结果可取算术平均值，保留小数后二位。 六、注意 1）加碱蒸馏时如有氧化铜棕色沉淀发生，说明加碱量已足够。 2NaOH+CuSO4→Cu(OH)2+Na2SO4 Cu(OH)2→CuO↓+H2O 2)把吸收瓶装好后再加碱免NH3，逃逸。 习题 1.如果用标准盐酸吸收，要完成实验，应增加什么步骤？ 2.如何检查蒸馏是否完全？如果用标准盐酸吸收，定氮实验中要增加什么步骤？测定氨基酸时也要进行水解，与定氮实验中消化水解过程有什么区别？ 3.整个实验过程中，下列那些操作要十分精确，那些可不十分严格？ 样品称量，硼酸体积，饱和NaOH 差示紫外光谱法测定大豆蛋白的构象稳定性 一、实验原理 蛋白质变性使分子中酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基所处的微环境发生变化，从而引起紫外吸收波长改变。由于这种变化较小，直接测定时误差较大，而紫外差示光谱法则可以将光谱曲线的微小变化放大，减少测定的误差。本实验以盐酸胍作为变性剂，测定280nm处紫外差示吸收ΔA280随变性剂浓度的变化情况。从紫外差吸收可以计算出蛋白质在不同变性剂浓度下的变性的分数，再经过作图，将变性剂浓度外推到0即为蛋白质的构象稳定性。 二、实验材料 1. 盐酸胍（分析纯） 2. 大豆蛋白质凝乳 三、仪器设备 离心机、烧杯（250ml）、紫外分光光度计、0.5cm石英比色皿、旋涡混合器、具塞试管10ml、试管架、移液管、电磁搅拌器、pH计、台式离心机、水浴锅、塑料保鲜膜。 四、样品制备 1. 称取湿凝乳10克，置于250ml烧杯中，加入30ml水，待完全分散后用1N NaOH溶液将pH调至7.0，电磁搅拌10分钟。然后于3000 rpm离心10分钟，后所得上清液即为大豆蛋白储备液。 2.制备6.67mol/L1.取10ml试管1支，加入大豆蛋白储备溶液0.5ml，然后加入蒸馏水4.5ml。 2.取10ml试管10支，分别加入大豆蛋白储备溶液0.5ml，然后分别加入蒸馏水4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0.0ml，再分别加入盐酸胍储备溶液0.0、0.5