细胞培养基本技术答题.ppt

消毒 细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染 常见原因： 操作间或周围空间的不洁 培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底 由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染 消毒灭菌方法 物理消毒灭菌法 紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min 湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min 干烤：160℃, 2 小时 过滤：0.22μm 化学消毒灭菌法 70%酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理 1‰新洁尔灭 主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒 抗生素 主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 细胞培养用液的配制 蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 消化液 停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 培养细胞的生长过程 单个细胞的生长过程 细胞系的生长过程 细胞周期 间期 M期（有丝分裂期） G1期（ DNA合成前期） S期（ DNA合成期 ） G2期（ DNA合成后期） 细胞系的生长过程 原代培养期 传代期 衰退期 为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长至第一次传代的时期。 原代培养的细胞生长一定时间之后，如贴附型细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面，此时， 便应将原代细胞分开接种至2个或更多的新的培养器皿中，即传代，此即成细胞系。 一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰退死亡。 消化传代的步骤 培养细胞生长的条件 细胞的营养需要 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 无污染 无毒 无 毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与 细胞直接或间接接触的东西都必须 是无毒的。 无污染 微生物的污染 不同细胞类型的交叉污染 细菌 霉菌 支原体等 细菌污染 能改变培养液的pH值，使培养液变混浊。 细菌生长迅速，能消耗营养液和产生毒素。 抑制细胞的生长，毒性大的细菌可很快导致细胞崩解死亡。 荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体 Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体 扫描电镜法显示支原体 附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体 实验准备 实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒 超净台 超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 滤 器 CO2培养箱 CO