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时间分辨技术培训资料 现有的免疫学方法有几种。 有五种，分别为放射免疫、酶标免疫、荧光免疫、化学发光、时间分辨荧光免疫（TRF）。 现有的免疫学方法灵敏度最高的是那种。 灵敏度最高的为时间分辨荧光免疫（TRF）10-18mol/L，而酶标免疫为10-9mol/L，放射免疫和荧光免疫为10-12mol/L，化学发光为10-15mol/L其中的电化学发光为10-17mol/L。 什么是时间分辨荧光免疫（TRF）。 TRF分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，当反应体系发生后，用TRF仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系被分析物的浓度，达到定量分析之目的。 TRF技术是谁提出的。 1979年，芬兰SOINI和HEMMIA提出了“时间分辨荧光免疫分析”理论，1983年SOINI和KOJOLA提出以镧系元素标记为示踪螯合物和时间分辨荧光测量相结合，建立一种新的非放射性微量分析技术，现已经成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。 现有的免疫学方法有几种标记物。 现有的标记物有五种，分别为酶、同位素、荧光素、发光大分子物质、原子。 TRF的标记物是什么。 TRF的标记物是原子，采用的是镧系元素中的Eu铕、Sm钐、Te铽、dy镝及其螯合剂。 TRF原子标记物的特点。 发射光和激发光有较大的STOKES位移--------高特异性 长寿命荧光，降低其他干扰-------高灵敏度 半衰期长达几十万年，受干扰小---------高稳定性 原子标记与大分子标记物的对比。 原子标记物 大分子标记物 标记位点 多个，可达20个 只有1个 对被标记物蛋白活性影响 影响小，基本无影响 影响大，经常影响蛋白活性 对被标记物空间结构影响 无影响，保证稳定性 影响大，造成试剂的不稳定 受环境因素的影响 影响小 影响大，受温度， TRF技术中有几种分辨。 TRF技术中的分辨有两种分辨组成：时间分辨和波长分辨。 为什么叫时间分辨。（图1） 生物制品（如蛋白质）本身产生的荧光波长位于400-600nm，几乎覆盖整个可见光的波长范围，所以用普通荧光素来检测生物样品时，自然本底的荧光干扰太大。而在TRF技术中，由于镧系稀土离子螯合物所产生的荧光不仅强度高，而且半寿期也长，介于10-1000us之间，比普通荧光标记物高5-6个数量级。样品中蛋白质类的本底荧光衰变时间约为1-10ns（1000ns=1us）而我们使用的标记物铕和钐的荧光衰变时间分别为730000ns和50000 ns。因此利用延缓测量时间，待测样品中短寿命的自然荧光完全衰变后，再检测稀土离子螯合物的荧光信号（详见图1）。消除了来自样品、试剂及其他非特异荧光，从而达到降低自然本底荧光和消除样品荧光的干扰，大大提高了检测灵敏度。这既是我们常提到的时间分辨。 为什么叫波长分辨。 在TRF技术中检测的荧光信号是被动产生的荧光，所以就存在激发光和发射光。稀土离子的荧光激发光波长范围较宽，有利于增加激发能，提高稀土离子标记物的荧光信号。而发射光波长范围很窄，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。同时激发光和发射光之间有一个较大的Stokes位移（铕约为290nm），这十分有利于排除非特异荧光的干扰（既激发光对要检测的发射光的干扰），极大地增强了荧光信号测量的特异性，这就是TRF中波长分辨。（见图2） 什么叫Stokes位移。 Stokes位移是光学中的的概念，是指激发光谱与发射光谱之间的光谱波峰的波长差。例如TRF中铕的激发光波长340nm,发射光波长613nm，两者之间的波长差即Stokes位移约为290nm，所以激发光和发射光很容易用干涉滤光片分开（如图2）。而普通荧光物质的激发光与发射光之间的波长差即Stokes位移为28nm，那就很难排除激发光对发射光的干扰，影响检测结果。 稀土离子激发光、发射光和Stokes位移 稀土离子螯合物 激发光波长（nm） 发射光波长（nm） Stokes位移（nm） Eu-螯合物 340 613 273 Sm-螯合物 340 600 260 Tb-螯合物 295 490/543 195/248 Dy-螯合物 295 573 278 TRF的反应原理是什么。（图3） 三价稀土离子螯合剂在水溶液中很容易与抗原分子以共轭双键结合，形成螯合物，当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，反应后，免疫复合物中抗原抗体结合部分，就含有稀土离子，将结合和游离部分分开，利用分析仪器测定复