实验13经典免疫技术讲解.ppt

实验十三 经典免疫技术 实验目的要求 1、掌握直接凝集反应的原理和操作方法 2、熟悉免疫标记技术的原理和操作方法 一、凝集反应 为一种血清学反应。颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电介质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。 （一）实验原理 1、直接凝集反应（原理） 颗粒状抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。分为玻片法和试管法。 （1）玻片法是一种定性试验方法。可用已知抗体来检测未知抗原。若鉴定新分离的菌种时，可取已知抗体滴加在玻片上，将待检菌液一滴与其混匀。数分种后，如出现肉眼可见的凝集现象，为阳性反应。该法简便快速，除鉴定菌种外，尚可用于菌种分型、测定人类红细胞的ABO血型等。 （2）试管法是一种定量试验的经典方法。可用已知抗原来检测受检血清中有无某抗体及抗体的含量。用来协助临床诊断或供流行病学调查研究。操作时，将待检血清用生理盐水连续成倍稀释，然后加入等量抗原，最高稀释度仍有凝集现象者，为血清的效价，也称滴度，以表示血清中抗体的相对含量。诊断伤寒、副伤寒病的肥达反应、布氏病的瑞特氏反应均属定量凝集反应。 2、间接凝集反应 将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用。在有电介质存在的适宜条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应。用做载体的微球可用天然的微粒性物质，如人（O型）和动物（绵羊、家兔等）的红细胞、活性炭颗粒或硅酸铝颗粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯胶乳微球等。由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上的抗原与微量抗体结合后，就足以出现肉眼可见的反应，敏感性比直接凝集反应高得多。 + ? （二）材 料 标准抗A、抗B诊断血清；受测者红细胞、盐水、采血针、棉球、玻片等。 待测细菌纯培养物，标准诊断血清 （三）方 法（血型测定） 1．取一块清洁玻片，用记号笔划上记号，左上角写A字，右上角写B字。 2．用小滴管吸A型标准血清（抗B）一滴加入左侧，用另一小滴管吸B型标准血清（抗A）一滴加入右侧。 3．穿刺手指取血，玻片的每侧各放入一小滴血，用牙签搅拌，使每侧抗血清和血液混和。每边用一支牙签，切勿混用。 4．静置室温下数分钟后，在白色背景下肉眼观察，也可显微镜观察。 注意事项： 1、采血时要尽量避免用力挤压手指或耳垂，以免发生溶血影响结果。 2、如肉眼观察难以辨认，可使用显微镜观察凝血现象。 操作流程 （三）方 法（细菌菌型测定） 1.取一块清洁载玻片，用记号笔划上记号，在一侧滴加标准的诊断血清一滴,另一侧滴加一滴生理盐水。 2.用接种环无菌操作取适量的待测细菌,分别与标准诊断血清和生理盐水混均。 3.静置室温下数分钟后，在白色背景下肉眼观察，也可显微镜观察。 注意事项： （1）生理盐水、诊断血清要适量； （2）待检菌为肠道致病菌，注意无菌操作，玻片用后放入消毒缸内； （3）用接种环取待检菌时，不要挑取琼脂；待检菌与生理盐水、诊断血清混匀时，不要涂得太宽，否则影响结果观察。 （四）结果判断 结果分析 人类ABO血型抗原是根据红细胞膜上有无特异性抗原（凝集原）A或B来划分的血液类型系统，将血型分为A型、B型、AB型、O型四种。 RBC膜 抗原 无 血型 A B AB O 抗A、抗B) 无 抗A 抗B (血浆抗体 B A A和B 二 、沉淀反应（双向琼脂扩散试验） 又称双向琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反应。 琼脂是多孔的网状结构，可使大分子物质通过，分子的扩散作用使分别两处的抗原抗体相遇，比例合适时形成沉淀，可观察到沉淀线。 沉淀线的特征与位置取决于抗原分子的大小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗体存在多种体系时，会出现多条沉淀线。 因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度比较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。 （一）实验原理 （二）材料 玻片、琼脂糖、抗原、抗体（0；1:2； 1:4； 1:8； 1:16）、微量加样器、滴管、湿盒、水浴箱等。 （三） 操作步骤 1.制板：将溶化的1.5%琼脂3.5-4ml倒在载玻片上，使之能将表面覆盖，制成厚度约2～3mm厚的琼脂糖凝胶板。 2.打孔:待冷却后根据所需形状打孔,孔径为4mm。孔间距离为4mm-5mm;琼脂玻板的制备十字型打孔图。 3.加样:用微量加样器取Ag10uL加入中央孔;将抗体进行倍比稀释,稀释度分别为原液,1:2;1:4;每个稀释度取10uL加入外围抗体孔中。 4.扩散: 置湿盒37℃, 24小时观察结果 每孔加入 抗原/抗体10μl 注意事项