甘薯蛋白癌作用研究进展.ppt

Karnofsky（卡氏，KPS，百分法）功能状态评分是一种肿瘤病人生存质量评分，得分越高，健康状况越好，越能忍受治疗给身体带来的副作用，因而也就有可能接受彻底的治疗。得分越低，健康状况越差，若低于60分，许多有效的抗肿瘤治疗就无法实施。 * 铁蛋白（ferritin，Fer）：是一种铁结合蛋白，存在于各组织，病理状态下释放入血液中，不是肿瘤特异的标志，在多种癌症患者血液中，均有不同程度的阳性率，肝癌患者的阳性率在70%以上，所以可辅助诊断肝癌。此外在进展性乳癌患者铁蛋白水平也有显著提高，且与病程有关。 * 肿瘤抗原CA199：升高多见于胰腺癌，也可见于结肠癌、肝癌、胆囊癌，因此，其特异性不是特别高。 糖类抗原242阳性见于消化道肿瘤。 * 甘薯蛋白抗癌作用研究进展 汇报内容 立题依据 1 总结 4 研究内容和技术路线 2 研究结果 3 我国甘薯（Ipomoea batatas）产量世界第一 （约1亿吨/年），其中约50 %用于生产淀粉、粉丝等初级产品，附加值低，加工过程中产生大量废液、废渣。 废液中含1 %左右可溶性蛋白，直接排放不仅 浪费资源，而且污染水质，亟待解决。 甘薯块根中特有的贮藏蛋白Sporamin占其蛋白 总量的60-80 %，本实验室前期研究表明，Sporamin能显著抑制人结肠癌HCT-8细胞在裸鼠腹腔内的弥散性生长，并抑制皮下接种的Lewis肺癌细胞在C57黑鼠体内自发性的肺转移。 因此，本课题继续对sporamin的抗癌作用及其细胞内分子作用机制进行了探索。 细胞实验：观察甘薯蛋白对3种癌细胞（人结肠癌HT-29细胞、HepG2肝癌细胞、Bcap-37乳腺癌细胞）增殖及转移扩散能力的抑制作用，并探索其相应的细胞内信号转导机制。 临床试验：观察甘薯蛋白（SPP）与5-氟尿嘧啶 （5-FU）联用治疗人结肠癌的安全性及有效性。 本研究意义在于： 探索甘薯蛋白在防治恶性肿瘤方面的作用和应用价值，为开发新型抗癌药物奠定基础。 提高甘薯加工的利用率和产品附加值。 有助于解决我国甘薯淀粉加工业废水污染环境的问题 。 目的：观察甘薯蛋白对3种恶性肿瘤细胞增殖及侵袭转移能力的抑制作用，探索其细胞内分子作用机制。 实验内容： MTT 结晶紫染色 荧光染色 划痕愈合实验 抗粘附实验 明胶酶谱试验 uPA分泌量测定(ELISA) 免疫印迹 RT-PCR 细胞培养：从中国科学院细胞库购买各种肿瘤细胞株，按照推荐的方法采用合适的培养基和培养条件在二氧化碳培养箱（37 °C，5% CO2）中培养。 条件培养液（CM）的制备：肿瘤细胞株在培养板中长满后，换成1%小牛血清的培养液并移入可调节氧气浓度的CO2培养箱中继续培养24 时，24小时后取出培养板，吸出上清液冻干后备用。 MTT法细胞生长分析：将肿瘤细胞接种于96孔板（10，000 cells/well），加含10%胎牛血清的完全培养基培养24 h，然后将培养基换成含有或不含有各种处理试剂的RPMI 1640培养基。分别在换液后的1、3、5天测定细胞增殖情况，采用MTT法，加入20 μg vital染料MTT（1 mg/ml）后继续培养4 h，被细胞吸收的蓝色染料用DMSO（100 μl/well）溶解，测定其在490nm处的吸光度。正式实验前先做预实验检查吸光度和细胞数量之间是否成正比。 划痕愈合实验：将细胞按1-5 x 105个/孔的密度接种于12 孔培养板；形成单层细胞后，用20-200 微量pipette管尖端刮一个宽1 mm的划痕；用新鲜培养基洗两次，然后换成含不同浓度甘薯蛋白的培养基，37 ℃孵育20 h后用PBS冲洗，4 ％多聚甲醛固定，在刮伤0 h和20 h后分别照相（放大100 倍），用ImageJ图像软件计算刮口的平均距离。细胞愈合划痕的能力用它们的运动距离表示，计算方式如下：（0 h时划痕的平均距离-20 小时后划痕的平均距离/ 0 h时划痕的平均距离）× 100。 抗粘附试验：将细胞接种到24孔板或6孔板，形成单层细胞后脱血清过夜培养，换含不同浓度甘薯蛋白和PMA的培养基处理24 h，然后用PBS冲洗2遍，加入200 或500 μL 0.25% trypsin/0.1 mM EDTA ，室温，100 RPM振荡消化细胞，记录细胞完全脱落需要的时间. 酶谱法测定MMPs和uPA的活性：分别用明胶酶谱和纤溶酶原-酪蛋白酶谱法测定条件培养基中分泌的MMPs和uPA的活性，用含或不含100ng/ml PMA及不同浓度甘薯蛋白的培养基处理细胞4 h，收集培养基，过滤除去悬浮细胞，用浓缩离心管浓缩25-50倍，各组取等量培养基与不含SDS和β-mercaptoethanol的样品缓冲液混合后上样，用含2 mg/ml 明胶的10 %