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革兰氏染色及镜检操作规范培训 质量管理部 目录 一、革兰氏染色法 二、革兰氏染色原理 三、仪器设备、试剂 四、操作方法 五、镜检及结果判定 六、革兰氏染色图片 七、革兰氏染色注意事项 八、革兰氏染色小结 一、革兰氏染色法 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。 二、革兰氏染色原理 G+菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多且交联程度大，故经酒精脱色，失水而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故酒精处理，能把结晶紫和碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色。 三、仪器设备、试剂 生物显微镜 载玻片 草酸铵结晶紫染色液 革兰氏碘液 沙黄复染液或番红染色液 95%乙醇 5、革兰氏染色液配制 5.1草酸铵结晶紫染液 A液：结晶紫2g?，95%乙醇20mL。 B液：草酸铵0.8g，?蒸馏水80mL?????? 混合A液及B液，静置48h后使用。 5.2碘液配制 碘片1g，?碘化钾2g?，蒸馏水300mL?????? 配制方法：先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加够蒸馏水即可。 5.3番红复染液配制 番红2.5g，?95%乙醇100mL??????? 取上述配好的番红乙醇溶液10mL与80mL蒸馏水混匀既成。 四、操作方法 1、制片 在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水。 用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层。 2、自然干燥 涂片最好在室温下使其自然干燥。 有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 3、固定 标本干燥后即进行固定，固定的目的： １）杀死微生物，固定细胞结构。 ２）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。 ３）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。 4、初染 滴草酸铵结晶紫染1分钟 蒸馏水冲洗。 5、媒染 加革兰氏碘液染1分钟 蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去水分。 6、脱色 加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后立即用蒸馏水冲洗。 用吸水纸吸去水分。 7、复染 蕃红染色液（稀）（或沙黄）复染液染1分钟后，用蒸馏水冲洗，并自然干燥。 镜检。 五、镜检及结果判定 接通显微镜的电源，调节光线的强度。 将载玻片放在载物台上，调节镜头至油镜镜头处，调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋至清晰为止。 观察菌落形态及菌体的颜色。 革兰氏阳性菌染色呈紫色，革兰氏阴性菌染色呈红色。 七、革兰氏染色注意事项 标本涂片不能太厚，若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不在出现紫色为止。 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水。 * * 细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，革兰氏阳性菌（G+）不被脱去，革兰氏阴性菌（G-）可被脱去。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。 有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应； 弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现阴性反应。 G+和G-生物学特性的差异 弱 强 对机械力的抗性 以内毒素为主 以外毒素为主 产毒素 基体上着生4个环 基体上着生2个环 鞭毛结构 高 低（仅抗酸性细菌含有类脂） 类脂和脂蛋白含量 有 无 脂多糖（LPS） 有 无 外膜 无 多数含有 磷壁酸 薄，一般单层 厚，层次多 肽聚糖 可经脱色而复染成红色 能阻留结晶紫而染成紫色 革兰氏染色反应 G-细菌 G+细菌 比较项目 阴性菌 阳性菌 G-菌因其细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄且交联程度低（松疏），经酒精脱色后，以类脂为主的外膜迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘的复合物的溶出，因此细胞退成无色，再经沙黄等红色染料复染，就使G-菌呈红色。 为避免因菌数过多聚成团，不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。 若材料为液体培养物或固体培养物冲洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可 手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上。 在酒精灯外焰尽快的来回通过3—4次，共约2—3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）, 放置待冷后，进行染色。 六、革兰氏染色图片 革兰氏染色的大肠杆菌 革兰氏染色的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌 革兰染色的伤寒沙门菌 革兰染色的福氏志贺菌