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生 物 化 学 实 验（上）实验一 酶促反应动力学实验· 底物浓度对酶活性的影响· pH对酶活性的影响· 温度对酶活性的影响 华中科技大学生命科学与技术学院2014级生物化学小老师 第一组酶促反应动力学综合实验实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定【实验目的】1.了解底物浓度对酶促反应速率的影响2.掌握米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km的方法。【实验原理】1.米氏方程： (1)式中：v表示酶促反应速率， 表示酶促反应最大速率， [S]表示底物浓度， Km表示米氏常数。v=Vmax×[S]/（Km+[S])，这个方程称为Michaelis-Menten方程，是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的，其中 Km 值称为米氏常数，Vmax是酶被底物饱和时的反应速度，[S]为底物浓度。由此可见Km值的物理意义为反应速度v达到1/2Vmax时的底物浓度（即Km=[S]），单位一般为mol/L，只由酶的性质决定，而与酶的浓度无关。可用Km的值鉴别不同的酶。当底物浓度非常大时，反应速度接近于一个恒定值。在曲线的这个区域，酶几乎被底物饱和，反应相对于底物S是个零级反应。就是说再增加底物对反应速度没有什么影响。反应速度逐渐趋近的恒定值称为最大反应速度Vmax。米氏常数Km是酶促反应速度v为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。这可通过用[S]取代米氏方程中的Km证明，通过计算可得v=Vmax /2。2. Km值的测定主要采用图解法，有四种： ①双曲线作图法（图a）根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测一个近似值，因而1/2不精确。此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。 ② Lineweaver- Burk作图法—双倒数作图法（图b）实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lineweaver- Burk方程式： (2)以对作图，即为y=ax+b形式。此时斜率为，纵截距为。把直线外推与横轴相交，其截距即为—。 ③Hofstee作图法（图略,不要求）把（2）式等号两边乘以Vmax，得： (3)以v对作图，这时斜率为，纵截距为，横截距为。④Hanas作图法（图略，不要求）把（2）式等号两边乘以[S],得： (4)以v对作图，这时斜率为，纵截距为。 （a） (b)本实验主要以双倒数法，即Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。具体原理如下：本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下，准确反应15分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长660nm比色。在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。反应式如下： 然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度（思考分析这样处理的原理及合理性），即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。【仪器与试剂】仪器：恒温水浴锅；721型分光光度计；试管 ；吸量管 ；移液枪 ；烧杯 。试剂：酚试剂2.5mM磷酸苯二钠基质液碱性缓冲液（pH10.0）碱性磷酸酶【注意事项】1. 加入碱性磷酸酶的量要准确，并且提前进行预热。2. 保温时间要准确，不同试管加热时间须保持一致，注意计时方法。3、磷酸苯二钠为2.5mmol/L，注意与后两个试验区分。4、使用分光光度计和移液枪时注意操作步骤。【实验步骤】取6支试管按下表加入试剂：0号管切勿加酶！0123452.5mM磷酸苯二钠（mL）1.00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）0.20.80.60.40.2------碱性缓冲液（pH10.0）（mL）1.01.01.01.01.01.0混匀后，37℃预温5分钟。注意：碱性磷酸酶溶液应先放于水浴锅中预热达到37℃，再滴加到试管中参与反应碱性磷酸酶液（mL）------0.20.20.20.20.2混匀后，37℃水浴15分钟（准确计时）。注意：1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确。（用移液枪加）2）酶促反应溶液总体积2.2mL。3）第0管不加酶，基本无反应。酚试剂（mL）1.01.01.01.01.01.010%Na2CO3 (mL)2.02.02.02.02.02.0混匀后，37℃水浴15分钟（准确计时）。注意：1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故加入酚试剂后酶促反应停止。 2）Na2CO3 提供碱性环境，加入Na2CO3 后试剂才显色，37℃水浴使显色充分。以0号管调零，在660nm波长处比色。【结果处理】1．将各管光密