第六章基因重组与基因工程..docVIP

第六章 基因重组与基因工程 教 学 大 纲 要 求 1.熟悉基因工程、基因文库、载体、限制性核酸内切酶、PCR等概念； 2.掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基本过程； 3.了解重组DNA技术在医学上的应用。 教 材 内容 精 要 一、自然界的基因转移和重组 自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演 变、进化的基础。基因重组的方式有：接合作用、转化、转导、转座。 1．接合作用(Conjugation) 当细胞(细菌)与细胞(细菌)相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞(细菌)转移到另一个细胞(细菌)。 2．转化与转导作用 (1)转化作用(Transformation)：由外源性DNA导入宿主细胞，并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程，称为转化作用。 (2)转导作用(Transduction)：当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来，再次感染另一 (受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。 3．转座(转位)(Transposition) 可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。故由插入 序列和转座子介导的基因转移或重排称转座。转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。可分为插入序列(insertionsequenceIS)转座和转座予(transposons)转座。 4．基因重组 不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。基因重组有两种类型： 位点特异的重组(sitespecial recombmatlon)和同源重组(homologous recomblnation)。 二、重组DNA技术 ’ 1．重组DNA技术的相关概念 (1)DNA克隆：克隆(Clone)就是来自同一个体的相同的集合。DNA克隆（DNA clone）：应用酶学方法在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的重组DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子的过程。DNA克隆又称基因克隆或重组DNA。DNA克隆也指将DNA重组体引进受体细胞中，建立无性系的过程。因此，又称为基因克隆(gene cloning)、基因工程(gentre engneering)、重组DNA技术。 (2)工具酶；常用的有：内切酶、连接酶、聚合酶I、反转录酶等。在所有工具酶中以限制性内切核酸酶最重要。限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是指能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。根据组成和作用特性的不同，常用的限制性核酸内切酶可分为三类。，重组DNA技术用到的为Ⅱ类。其特点为：①具有识别特异性：识别DNA分子上特定的核苷酸序列，该序列一般呈回文结构(Palindrome)，如：E．CoRI识别的序列为5￠ GAATTC 3￠。②具有切割特异性：从某一特定位点或其周围切割，产生后产生粘性本端或钝性末端，如：E．CoRI从G和A之间切开，产生两个 粘性本端（5￠ G↑AATTC 3￠）。不同的限制性内切核酸酶识别DNA中的核苷酸长短不一，切割位点的多少也不同，产生的片段大小各异。 (3)目的基因：目的基因(target gene)是我们要研究或利用的DNA序列或基因，称为目的基因。目的DNA有两种类型：cDNA和基因组DNA。cDNA(Complementary DNA)是以RNA为模板，经反转录合成的与RNA互补的单链DNA。以cDNA为模板经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA(genomic DNA)是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。 (4)基因载体：也叫克载隆体(cloning vector)是携带目的基因，实现目的基因的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。具有转录和翻译所必须的DNA序列，可以完成目的基因表达过程的载载体称为表达载体(expression vector)。作为载体，必须要有独立的复制能力，可导入宿主细胞，并且要便于检测。常用的载体有质粒DNA、噬菌体DNA、和病毒DNA。质粒(P1asmid)是存在于细菌染色体以外的环状DNA分子。质粒大小适宜，拷贝数多，易于转化，利于筛选，有理想的酶切位点。噬菌体(phage)是侵袭细菌的病毒。常见的噬菌体有l噬菌体和M13噬菌体。基因工程所使用的噬菌体DNA均是经过人工改造的。Ml3噬菌体的基因间隔区插入E．Co1i的调节基因及LacZ N一端146个aa残基编码基因，其产物为b-半乳糖苷酶的a-片段。而突