蛤蚧乙醇提取液对大鼠卵巢颗粒细胞影响的实验研究.docVIP

蛤蚧乙醇提取液对大鼠卵巢颗粒细胞影响的实验研究 【摘要】 目的：研究蛤蚧乙醇提取液对大鼠卵巢颗粒细胞的影响。方法：3月龄和6月龄的Wister雌性大鼠各20只，随机分为实验组和对照组各10只；实验组大鼠给予蛤蚧乙醇提取液灌胃，对照组大鼠给予生理盐水灌胃。15 d后取卵巢做免疫荧光；分别用激光共聚焦显微镜检测IGF1、inhibinа(Inh A)并测各组的荧光强度值。结果：实验组与对照组比较IGF1、InhA，均有升高，差异有统计学意义，对照组IGF1的表达６月龄组高于３月龄组（Plt;0.05），Inh A的表达在实验组和对照组中６月龄组均高于３月龄组（Plt;0.01）。结论：蛤蚧乙醇提取液能显著提高IGF1和Inh A在大鼠卵巢中的表达，从而改善大鼠卵巢功能，促进优势卵泡和黄体的发育。 【关键词】 蛤蚧；卵巢；大鼠 蛤蚧是壁虎科动物Gekko gecko的干燥体。全年均可捕捉，除其内脏拭净，用竹片撑开使全体扁平顺直，低温干燥。主产于广西、云南、贵州等地，味咸性平，归肺、肾经，具有补肺益肾、纳气定喘、助阳益精功效，用于虚喘气促、劳嗽咳血、阳痿遗精。肝脏分泌的胰岛素样生长因子（IGF1）能刺激颗粒细胞DNA的合成，促进卵泡发育，并能有效抑制体外预排卵卵泡颗粒细胞凋亡的发生。颗粒细胞分泌的抑制素（inhibin）的含量在衰老的卵巢中明显减少。因此，抑制素被公认为是衡量卵巢贮备能力、卵巢衰老的理想指标［1］。本课题从影响卵巢功能的局部调节因素着手，通过研究大鼠不同年龄阶段卵巢细胞生长因子IGF1、抑制素（inhibin）含量的变化，探讨卵巢衰老及蛤蚧抗卵巢衰老作用的机制，从而寻求延缓和治疗卵巢衰老的新方法、新途径。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　Wistar大鼠（由重庆医科大学动物中心提供）；兔抗鼠IGF1多抗购于武汉博士德公司，鼠抗人inhibinа、兔抗鼠NCadherin多抗、FITC羊抗兔IgG、TRITC羊抗鼠IgG等均购于北京中山生物技术公司。激光共聚焦显微镜由重庆医科大学基础医学研究所提供（Leica sp2，德国）。 　　1.2 蛤蚧乙醇提取液的制备 将干品蛤蚧体60 ℃烘干后打成粉末，60%乙醇浸泡7 d后过滤去残渣，滤液用旋转蒸馏器蒸馏去除乙醇达饱和后置于4 ℃冰箱备用，每毫升蛤蚧乙醇提取液含蛤蚧原药0.25 g。 　　1.3 动物分组 取Wister大鼠3月龄［平均体重（180±11）g］和6月龄［平均体重（230±13）g］各20只，随机分为实验组和对照组，每组各10只。实验组按原生药2 g/(kg·d)剂量灌胃，共15 d，对照组相同体积生理盐水灌胃，共15 d。 　　1.4 标本制备 于末次灌胃后24 h处死大鼠，采集卵巢标本；按常规制备大鼠卵巢的石蜡标本并切片备用。 　　1.5 免疫荧光标本的制备 取各组的大鼠卵巢石蜡切片常规脱腊至水。冷PBS漂洗2 min × 3 次，加封闭羊血清20 μL，10 min后倾去羊血清不洗。各组分别滴加一抗：兔多抗IGF1（1∶50），鼠抗人inhibin_а，荧光空白对照组用PBS代替，4℃湿盒内孵育过夜。冷PBS漂洗2 min × 3 次，兔多抗IGF1（1∶50）组滴加二抗：FITC羊抗兔F（ab）（1∶50）；鼠抗人inhibin_а组滴加TRITC羊抗鼠IgG；37 ℃湿盒内孵育45 min。冷PBS漂洗2 min × 3 次，50％缓冲甘油封固，在激光共聚焦显微镜下观察。FITC标记的IGF1显现黄绿色荧光。TRITC标记的inhibin_а显现红色荧光。 　　1.6 观察和测定方法 激光共聚焦显微镜观察标本并摄像存储，用激光共聚焦显微镜自身的图像分析系统测量并分析各组的平均荧光强度值。因FITC羊抗兔F（ab）经抗原抗体识别反应特异地结合于IGF1，因此荧光强度值能准确地表示IGF1的相对数量。同样TRITC的荧光强度值则能准确地表示Inh A的相对数量。所有数据均为定量数据，结果采用t检验分析。 　　2 结果 　　2.1 大鼠卵巢IGF1和Inh A平均荧光强度值 经激光共聚焦显微镜观察并测量荧光强度值，然后计算各组平均荧光强度值。具体数值见表1。从表1的结果可以看出，蛤蚧醇提液能显著提高IGF1在不同月龄（3月龄和6月龄）Wistar大鼠卵巢中的表达（P＜0.01），同时能显著提高Inh A在不同月龄（3月龄和6月龄）Wistar大鼠卵巢中的表达（P＜0.01），提示蛤蚧能改善大鼠卵巢的功能，促进优势卵泡和黄体的发育。从表1还可得知，对照组中6月龄组IGF1和Inh A均显著高于