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结核分支杆菌katg蛋白的高表达与纯化
结核分支杆菌katG蛋白的高表达与纯化
关键词:分支杆菌结核;katG;基因表达;蛋白纯化
【摘要】目的 表达与纯化结核分支杆菌katG蛋白,为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础。方法 将含有katG基因的pET24b-katG表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,分别对不同诱导时间的表达产物进行SDS以及考马斯亮蓝染色。获得稳定的高表达菌株后采用XpressTM蛋白纯化系统对超声破菌液进行纯化。最后对纯化产物进行过氧化氢酶活性的初步检测。结果 对诱导后的重组大肠杆菌菌液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)以及考马斯亮蓝染色后发现相对分子质量约为80000。表达蛋白量约占总蛋白量的17.7%。对重组katG基因表达产物进行纯化的结果发现,以350mmol/L咪唑洗脱时的纯化效果最理想,蛋白纯度可达90%以上。对表达产物进行过氧化氢酶活性初步检测证明,重组的katG基因产物具有过氧化氢酶活性。[HTH〗结论 通过pET24b-katG表达质粒转化大肠杆菌可获得基因重组的katG高表达菌株,表达产物具有一定酶活性,经纯化后可达到较高的纯度。
Overexpressionandpurificationofcatalase-peroxidasekatGfrommycobacteriumtuberculosis
【Abstract】Objective Toexpressandpurifythecatalase-peroxidasekatGgenefrommycobacteriumtuberculosis.Methods PlasmidpET24bcontainingkatGwastransferredintocompetentEscherichiacoliandkatGgenewasoverexpressedbythechallengeofisopropylthio-β-D-glactoside(IPTG).TheexpressionofkatGproteinwasone-steppurifiedbyXpresssystemTM.Furthermore,thecatalaseactivityofkatGproteinwaspreliminarilydetected.Results TherecombinantescherichiacoliproducedkatGproteininlargequantities,accountingfor17.7%oftotalcellprotein.ThemolecularmassofkatGproteinwasestimatedtobe80000bysodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegradientgelelectrophresis(SDS).Itwasfoundthatimidazoleattheconcentrationof350mmol/LcouldelutethekatGproteinmostefficientlyandyieldthefinalpreparationatgreaterthan90%purity.ThekatGproteinwaspreliminarilydetectedtohavetheactivityofcatalase.Conclusions ThestablekatGoverexpressingrecombinantEscherichiacolicanbeconstructedbytheplasmidpET24bcontainingkatGgene.TherecombinantstraincanproducekatGproteinwithcatalaseactivityandtheproductofwhichcanbepurifiedintohigheractivity.
【Keywords】Mycobacteriumtuberculosis;katG;Geneexpression;1
nbsp;Proteinpurification
异烟肼(INH)是一种最经济有效的抗痨药,几乎所有的抗痨方案中均包括INH。结核分支杆菌编码的katG基因的突变可致结核分支杆菌对INH产生耐药性[1]。自1992年以来,对于katG基因变异或缺失造成分支杆菌对异烟肼耐药的基因水平研究已较为深入[1,2],有必要在蛋白水平对耐药机制进行进一步研究。本研究将含有katG基因的pET24b-katG表达载体转化埃希大肠
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