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单分子测序PacBio技术和应用解决方案 一、 技术原理 SMRT：single molecular real time Sequencing PacBio RS，RS表示Real time Sequencing 关键之一：DNA聚合酶 基本原理：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基，经过Watson配对后不同的碱基加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。和其他基本测序技术一样，在反应管中进行的是大规模平行的多分子反应，怎样在其中进行单分子反应检测？周围有大量的荧光标记的游离碱基，怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来？ 通过一个物理现象解释：ZMW（zero-mode waveguides，零模波导孔）。例如微波炉壁上可看到有很多密集的小孔。小孔直径有考究，如果直径大于微波波长，能量就会穿透面板泄露。如果孔径小于波长，能量不会辐射外部，起保护作用。 在一个反应管（SMRTCell：单分子实时反应孔）中有许多这样的圆形纳米小孔，即ZMW（零模波导孔），外径100多纳米，比检测激光波长小（数百纳米），激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围（体积20X 10-21L）里，正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，将背景降到最低。 单个ZMW底部固定有一个结合了模板DNA的聚合酶，当加入测序反应试剂后，每个碱基配对合成后会发出相应的光并被检测。一个SMRTCell中有15万个ZMW，每个孔中有一个单分子DNA链在高速合成，如众星闪烁。原始检测数据的结果，每合成一个碱基即显示为一个脉冲峰，每分钟>100个碱基的速度，配上高分辨率的光学检测系统，就能实时检进行检测。 关键点之二：荧光标记位点。这是影响测序长度的非常关键的因素。二代测序都标记在5‘端甲基上，在合成过程中，荧光标记物保留在DNA链上，随DNA链的延伸会产生三维空间阻力导致DNA链延长到一定程度后会出现错读。这是NGS的测序读长仅能达到100多bp到200bp的一个原因。 PacBio平台的碱基荧光标记在3‘端磷酸键。在DNA合成过程中正确的碱基进入时，在3’端磷酸键的标记是会随磷酸键断裂自动被打断，标记物被弃去，亦即合成的DNA链不带荧光标记，和天然的DNA链合成产物一致，可以达到很长的读长。关键点之三：时空段概念 合成过程中，每次进入一个碱基，原始数据会实时地产生一个脉冲峰，每两个相邻的脉冲峰之间有一定的距离，也就是有一个时间段的概念。距离与模板上碱基是否存在修饰有关，如果有碱基修饰，就像开车经过路障时，通过速度会减慢，导致两个相邻峰之间距离加大。根据这个距离的变化，可以判断模板相应位点是否出现碱基修饰，并且结果是实时的。甲基化就是一种主要的碱基修饰，PacBio技术不仅可以提供序列信息，还可提供实时信息了解模板修饰的情况，用于甲基化等碱基修饰研究。 二、 测序流程和策略 配件：SMRT cell chip（小拇指指甲盖大小）。一条strip可以放8个SMRT cell，仪器一次可运行2条strip，共16个SMRT cell 文库构建试剂盒，测序试剂盒 流程和策略 1. 文库制备 材料：全基因组DNA，或者cDNA，或者目标扩增产物 片段化：全基因组太大需要片段化，因为测序读长很长，可以做很大的片段文库（3-10kb） 连接：先把片段粘末端变成平端，两端分别连接环状单链：单链两端分别与双链正负链连接上，得到一个类似哑铃（“套马环”）的结构，称为SMRT Bell。连接半小时内完成。（问题：片段化用什么方法？两端的环状单链是同一序列吗？如何确定单链方向？如果两端一样，如何分辨正负链？如何排除其他连接产物？连接效率有多高？如何纯化去掉酶？） 关于以上文库制备问题跟NGS类似，比如用片段化仪进行片段化，加接头等等。通过优化的实验protocol进行各步骤的优化。 如此，文库制备完成，简单快速。无需扩增。没有扩增偏向性，高或低GC含量区域覆盖均匀，尤其不会湮没稀有突变。 2 引物退火 + 聚合酶结合 当引物与模板的单链环部位退火后，这个双链部位就可以结合到已固定在ZWM底部的聚合酶上（问题：大分子DNA进入小孔的扩散速度？是否会存在有的ZMW没有模板进入的情况？SMRTCell中样本和测序反应体系的配置都是在测序仪中程序化自动完成的，简单快捷，标准化。会，目前的通量基于目前的进入效率，因此这方面还有提高的空间）。 3. 测序策略 万事俱备，一旦向反应中加入正常的离子，DNA聚合反应开始了。模板双链打开成环形，先合成正链，单链区，跟着合成负链。聚合酶每合成一圈，对于定向目标序列，就相当于2x覆盖度。由于合成产物和天然产物一致，聚合酶可以持续合成很长很长的产物