2 基因工程的酶学基.ppt

2 基因工程的酶学基础 第一节 限制性核酸内切酶 1. 来源 （2）修饰（Modification） （3）限制与修饰系统相关的三个基因 二、限制性内切酶的命名 三、限制性内切酶的类型 1. Ⅰ型限制性内切酶的基本特性 （2）切割位点 I型酶：限制修饰系统酶 异源多聚体，R、M、S分别为限制性内切酶、甲基化酶、特异位点识别的活性。 识别序列全甲基化-不识别 识别序列半甲基化-甲基化作用 识别序列未甲基化-限制性内切酶作用 识别序列与切割位点不一致，且切割位点随机不定 ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸） 2. Ⅲ型限制性内切酶 2. Ⅱ类限制性内切酶的基本特性 （2）切割位点 （3）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能 （4） II型限制性内切酶对单链DNA的切割 核酸限制性内切酶的类型及主要特性 四、限制性内切酶酶解反应条件 2. 酶解过程 配酶解体系 混匀 反应终止 酶解结果鉴定 ① 酶解体系 ② 混匀 ③反应终止 ④ 酶解结果鉴定 酶切后发现除了目的DNA条带外，还有其它条带 酶存在“星号”活性，造成非特异性切割； 不正确的操作，导致其它内切酶污染； 底物DNA中可能存在其它DNA污染。 （1）内切酶与识别序列的结合模式 （4） 几种常用限制酶识别位点 ① 大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液 ④ 酶分装成小份，避免反复冻融 五、影响限制性内切酶活性的因素 需要合适的底物：底物（DNA）纯度要高.不能含有RNA和蛋白质;也不能含有过高的EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他有机试剂。 DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为50ul内含1ug DNA。 2. DNA的甲基化程度 3. 温度 4. 缓冲液(Buffer) ① 在相同的缓冲液中反应同时进行 练习题 何为限制性内切酶？有哪些类型，各有什么作用和特点 什么是限制性内切酶的星号活性？受哪些因素影响？ 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是 【 】Ａ 修复自身的遗传缺陷 Ｂ 促进自身的基因重组 Ｃ 强化自身的核酸代谢 Ｄ 提高自身的防御能力 Ｅ 补充自身的核苷酸消耗 第二节 DNA 连接酶 二、DNA ligase的特点 2. 连接条件 三、连接反应的机理 四、连接反应的温度 五、影响连接反应的因素 六、DNA连接的反应体系 酶切纯化后的DNA片断 连接缓冲液 DNA连接酶 七、平头双链DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。 第三节 DNA聚合酶 二、常用的DNA聚合酶的特点 3. 常用DNA聚合酶的特性比较 三、DNA聚合酶在基因工程中的用途 （2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件 （3）用DNA聚合酶Ⅰ制备探针 ② 探针的标记方式 ③ DNA聚合酶I 对探针序列的标记 2. Klenow fragment （2）主要用途 ③ cDNA第二链的合成 3. T4 DNA聚合酶 ③ 特点 （2） T4 DNA聚合酶的用途 a. 放射性标记的优缺点： b. 非放射性标记 利用切口转移法将生物素掺入DNA探针中 ii）地高辛标记： 4. T7 DNA聚合酶 （2）T7 DNA聚合酶的特点 （3）T7 DNA聚合酶的用途 5. 修饰后的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶 （3）逆转录酶的用途 纯化的DNA片断 DNase I 制造单链缺口 DNA Pol I 进行缺口转移 biotin -dTTP和dNTPs 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 生物素-dTTP 生物素-dTTP 可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程，形成地高辛标记的DNA探针。 生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒 (kit)。 地高辛的结合物是抗地高辛抗体。 （1）来源 从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： ① T7噬菌体基因5编码的大亚基： T7噬菌体5蛋白。 有5’?3’聚合酶和3’?5’外切酶活性。 ② 大肠杆菌编码的小亚基： 硫氧还蛋白。 增加大亚基对模板的亲和性。 （4）DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50 - 100 mM，pH 7.5 MgCl2 10 mM ATP 0.5 - 1 mM DTT 5 mM Volume 10 - 20 ml T T 4 - 15 ℃ ， 4 - 16 hr 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小时，