9311农杆菌介导转化体系精选资料.docVIP

9311农杆菌介导转化体系（注：培养基“+”的为灭菌冷却到60℃后加）（一）诱导愈伤幼胚：取生长一致的植株，剥去主茎外层、叶鞘，将穗子剪成小段，在超净工作台上先用75％酒精浸5 min，用无菌水冲洗1次，再用次氯酸钠原液抽真空约10min至不冒气泡，再放于摇床振荡40min无菌水冲洗4～5次，然后在灭菌滤纸上小心挤出幼胚，放于诱导培养基（NB）上。每皿30粒，置于25~26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。除不能萌发的幼胚外，愈伤诱导率到达98%。幼胚的萌发和污染受幼胚灭菌效果和接种操作的影响，所以请小心操作。（大概一周左右能见愈伤从盾片中长出，视愈伤和芽生长情况选择掐芽继代时间，如图1） 图1 适合掐芽作继代的9311幼胚愈伤 成熟种子：分别挑选健康籽粒剥去颖壳，置于37℃培养箱过夜。种子取出后放入灭菌的三角瓶中，先用体积分数为75％的乙醇表面灭菌5min，用无菌水冲洗1次，0.1％HgCl消毒12 min，用无菌水冲洗5次，再放入次氯酸钠原液消毒40 min，无菌水冲洗5次，于灭菌的滤纸上晾干，然后接种到诱导培养基上（9311为NB+ ABA 1mg/L），让胚的一半接触培养基。每皿20粒，置于25~26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。（通过对四种基本培养基NBKNB、NB、MSTC、J0和NB+ ABA 0.5mg/L、NB+ ABA 1mg/L、NB+ NAA0.5mg/L、NB+