专题5DNA和蛋白质技术(个人初备教案).docxVIP

专题五 DNA和蛋白质技术 课题三 血红蛋白的提取和分离一、教学目标:1．尝识从血液中提取和分离血红蛋白，学习蛋白质提取和分离的一些基本技术2．了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理3．体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤4、初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神二、教学重点和难点: 重点：凝胶色谱法和电泳法的原理和方法 难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填三、教学方法：启发式教学，多媒体教学四、教学过程教学内容教师组织和引导学生活动修改（一）引入新课 你知道吗？1、分离生物大分子的基本原理是什么吗?2、怎么分离蛋白质分子呢?引言：分离生物大分子的基本原理是依据各种生物大分子的物理、化学性质的差异不同从而采取适当的方法将它们分离。分离蛋白质分子的原理也是一样，在分子生物学领域，如果没有这样的看似简单的分离提取技术的进步，也就没有那些伟大工程如人类基因组计划的实现。（二）进行新课1、基础知识 —— 蛋白质分离的基本原理和方法 请大家阅读书本相关内容及投影，完成以下空白处的问题 ：一、实验原理蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。1．凝胶色谱法（分配色谱法）：（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。（3）分离过程： 混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。（4）作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。2．缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。3．凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。阅读思考回答2、血红蛋白的提取和分离的实验设计二、实验步骤1．样品处理红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。②血红蛋白的释放 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。2．粗分离①分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。②透析 取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。3．纯化调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝↓ 胶面平齐，关闭出口。加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后，∣ 打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，↓ 关闭出口。调节缓冲液面：加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度↓洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。↓收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。4.纯度鉴定------SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）阅读思考回答3、注意事项三、注意事项电泳技术电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。2. 红细胞的洗涤如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉