同步辐射晶体学衍射.ppt

同步辐射晶体学衍射 董宇辉 BSRF，IHEP，CAS 什么是同步辐射？ 接近光速运动的电子或正电子在改变运动方向时放出的电磁辐射，因为是在同步加速器上发现的，所以称为同步辐射。 这种辐射强度高、覆盖的频谱范围广，可以任意选择所需要的波长且连续可调，因此成为一种科学研究的新光源。 同步辐射装置示意图 三种发光元件 同步辐射的作用 同步辐射的加入，大大提高了结构测定的速度。 PDB(Protein Data Bank) 同步辐射促进了蛋白质结构的解析 1980-1990年，获得解析的蛋白质数量大幅度增加； 1980左右，同步辐射开始应用到蛋白质结构解析中，1990年各种技术趋于成熟，同步辐射大规模应用于生物大分子结构解析。 SR vs NMR 80%以上的蛋白质结构由同步辐射晶体学衍射方法解析； 大约15%的结构由NMR（核磁共振）方法得到； 同步辐射解析结构所占的份量在不断的增加。 生物学家的评论 生物大分子结构测定影响了生物学几乎所有的领域。 几乎每个星期都有激动人心的结构发表在如Science和Nature这样的杂志上。 生物大分子晶体学已经比其他任何学科更多地得益于同步辐射的应用。 ------Steven E. Ealick, Cornell Univ. 生物大分子晶体 衍射能力很弱：大部分原子为C、N、O、S； 晶体质量差； 相位问题解决困难。 为什么要使用同步辐射 高亮度：衍射弱的晶体可以得到好的信号； 准直性好：质量差的晶体可以进行实验； 能量可调：可以进行多波长反常衍射实验（解决全新结构的有效方法）。 收集衍射数据的目的 确定出准确的结构因子F(hkl)。 收集单晶衍射数据的方法 回摆法：最常用 旋进法 魏森堡法 回摆法：rotation (oscillation) method 晶体的安装方式 蛋白质晶体的衍射 单晶样品冷冻 使用液氮冷却的干燥空气（防止结冰）来冷冻样品。 实践证明可以大大延长蛋白质晶体耐受同步辐射辐照的时间。 对于花费时间长的实验（如MAD）是必不可少的。 一般用100K的温度就可满足要求。 收集衍射数据的策略 是否需要冷冻？ 为了减少辐射衰减，需要冷冻。但是冷冻可能导致晶体损坏，往往需要防冻剂（有些晶体生长时使用的沉淀剂本身就有防冻效果）。 防冻剂需要尝试。（花费大量时间和精力的工作！） 不要破坏晶体，不出现冰的衍射（不结冰）。 选取冷冻条件 可能晶体本身就有抗冻能力。 安装晶体时尽量减少（生长晶体所用的）母液。 最简单的方法：把母液中部分水替换成甘油或蔗糖。 先找出没有结冰的替换条件，再尝试晶体是否不被破坏。 使用Hampton提供的防冻剂。 使用矿物油。 是否为需要的蛋白晶体 生长出来的晶体可能是其他成分，特别是结晶所使用的小分子试剂的晶体（盐晶）。 在衍射上可以判断：蛋白质晶体晶胞很大，起码有几十埃，衍射点很多，盐晶最大只有十几埃，衍射点很少。 蛋白晶体偏光弱，感觉很软（像果冻）；盐晶偏光强，感觉很硬（像盐粒）。 晶体的单晶性 如果要顺利的解析出结构，晶体的单晶性要好； 仔细观察衍射点的形状和衍射的上限：衍射点要圆而锐利，能达到的衍射上限不要低于3埃，否则结构解析就难了。 出现两个点很靠近的情况要小心：这可能不是单晶（孪晶），也会是晶胞某个轴特别长（移动探测器距离，处理一下衍射图）。一定要排除孪晶的可能性。 适合衍射的晶体 得到适合衍射的晶体是一件相当花费时间和精力的任务。 首先要得到大量的纯净蛋白质（分子生物学表达重组蛋白，生化手段纯化）； 寻找可能的结晶条件：如用Hampton公司的筛选试剂盒Index，Screen I和Screen II。 优化结晶条件：可能优化的条件很多，如沉淀剂浓度，盐浓度，离子强度，pH值，蛋白浓度等等等等。 得到大量的、衍射能力好的晶体。 筛选合适的防冻剂。 每一步都可能遇上困难。 探测器距离的设置 距离近可以收集到的衍射分辨率高，但是衍射点可能重叠（overlap）； 距离远可以使信噪比提高，衍射点分辨得好，但是能收集的分辨率降低。 经验：晶体中最长的晶胞长度数值（以埃为单位）=晶体到探测器距离数值（以毫米为单位）。 或者探测器最外面正好达到衍射分辨率上限。 高、低分辨率数据可能要分别收集（如果晶体分辨率极高）。 回摆角度、画面张数、曝光时间 回摆角度一般取1度。但是晶胞很大的情况下需要减少角度。不要出现回摆角度过大导致衍射点重叠。 需要收集的画面张数取决于晶体的对称性，至少要覆盖一个独立衍射区。当然在时间许可的情况下，越多越好。 曝光时间取决于晶体衍射能力，尽量使探测器的动态范围得到利用，也要考虑晶体的辐射耐受能力。 波长选择 波长越长，衍射强度会大（~l3）；但是吸收效应不好处理。 同步辐射上还是需要较短的波长，除非反常衍射需要