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《生物化学》 课程论文 学 院： 药学与生物工程学院 专 业： 生物工程 姓 名： 学 号： 关于蛋白质一级结构N末端分析Edman降解法的研究进展 作者 摘要 自Sanger揭开蛋白质测序的序幕后，Edman紧随其后，建立起一套可实现自动化的N端测序方法。然而，经典的Edman降解法受当时的条件限制具有一定的局限性。为了能紧跟时代的步伐，Edman降解法经历了从经典液相转变为固相再发展成如今的微流控芯片反应的蜕变，已经逐步适应了现在微量、效率、高准确度等序列分析要求。 关键词 蛋白质一级结构 N末端分析 Edman降解法 前言 蛋白质作为生命的物质基础,不同的蛋白质有不同的生理功能,要想揭开生命现象的奥妙,就必须进行蛋白质水平的研究[1]。而蛋白质中氨基酸序列的测定对了解其结构与功能以及生物进化、遗传变异的关系极有意义[2]。故对于蛋白质一级结构的末端分析方法的研究显得尤为重要。其中Edman降解法可以对蛋白质N端序列进行高精度分析，且准确度高，目前已实现自动化，具有广泛的应用前景。 1 Edman降解法的基本概况 经典的液相Edman降解法是由瑞典有机化学家P.Edman在上世纪50年代所创立的一套N末端分析方法，并在1967年,和Begg共同设计了自动蛋白质和多肽序列分析仪[5]。但是由于液相Edman降解法本身存在不足，在1966年，Laursen提出了固相的Edman降解法，并设计了固相的Edman序列分析仪[3]。在2007年，Chen对Edman降解法进行了进一步的完善，他在微流控芯片上进行Edman 反应，使得肽段测序的灵敏度提高到亚飞摩尔水平，实现了肽段快速、可靠的测序[4]。 2 Edman降解法的研究历程 2.1 Edman降解法的诞生 1953年，法国生物化学家Sanger 采用二硝基氟苯（FDNB）法，首次成功地完成了第一个蛋白质——牛胰岛素的序列分析[6],从而揭开了蛋白质一级结构研究的序幕。随后，瑞典科学家P.Edman在此方法的基础上，建立起Edman降解法。该法是让蛋白质多肽链N端的氨基酸与苯异硫氰酸酯在弱碱性的条件下反应生成苯氨基硫甲酰肽（简称PTC-肽）。在酸性环境下，后者环化生成苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）及N端少了一个氨基酸的肽链。在酸性条件下，生成的PTH-氨基酸极稳定，用乙酸乙酯抽提，PTH-氨基酸溶于乙酸乙酯，经过高效液相色谱鉴定可知N端是什么氨基酸。于是这种可以连续分析出N端的十几个氨基酸的测序分析方法正式诞生了。不久，根据这一原理设计的蛋白质自动顺序分析仪也问世[6]。 2.2 由液相到固相的转变 随着经典的Edman降解法被广泛的应用，其弊端也逐渐显现出来：①降解下来的氨基酸衍生物与母体肤链分离比较困难。②Edman的液相降解法要求实验操作严格,否则得不到满意的结果。③Edman液相序列分析仪结构复杂，鉴定一个氨基酸所需周期较长[7]。为了克服以上不足，1966年Laursren提出了固相Edman降解法并设计了固相的序列分析仪。而该法具体做法是：把蛋白质或多肤的梭基端或侧链基团与固相载体偶联,然后进行Edman降解反应。得到的苯基乙内酞硫脉一氨基酸(Phcynltihhoydantion,简称PTH-氨基酸),用过滤法即可与偶联于固相载体上的母体肤分离,也可使反应在柱中进行,用柱层析法分离PTH氨基酸和母体肤链[7]。这种做法，完美的克服了液相Edman降解法的不足，逐渐出现在国际视野里。但是,这种方法酸碱水解法的效果不佳，也没能但起N端测序的重任。 2.3 微流控芯片上的Edman反应 由于在微流控芯片中进行化学反应具有反应速度快、反应物用量少等特点。在2008年，穆金霞等[8]利用微细加工技术在微通道内加工制作了C18固相萃取微柱，通过将多肽吸附在C18 微柱后，用手工的方法依次重复地将三甲胺(TMA)、异硫氰酸苯酯(PITC)、三氟乙酸(TFA)等流过C18微柱，在微流控芯片中实现了Edman降解，继用质谱测定Edman降解前后多肽的分子量，得到蛋白质N端1个或2个氨基酸残基信息，提高了蛋白质测序列的准确度和专属性。到此，Edman降解法已经发展到比较成熟地步。与经典的Edman降解法相比较，已经大大提高测序的准确度，减少了实验操作难度，加强了自动化程度，减少了样品的用量。 3 讨论 从最初Edman降解法诞生，到如今的微流控芯片上的Edman降解法，N端分析手段是越来越简洁方便，为蛋白质组的研究打开了大门。同时，它自身的操作简单，测序准确度高，耗时少，且已实现自动化等的特点，就表明该法的