福建农林大学微生物综合实验实验报告.docVIP

《微生物综合实验》报告册 专业 2013级生物科学（生物学基地班） 学号 姓名 生命科学学院 二O一六年六月 实验一、细菌的分离与纯化 实验目的 1、掌握培养基的作用和NA培养基的配制 2、熟练掌握无菌操作技术（灭菌锅和超净工作台） 3、掌握分离菌种NA培养基主要成分为：牛肉膏蛋白胨aCl。蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；氯化钠能维持均衡的渗透压提供生长所需的矿物元素之一——；琼脂培养基的凝固剂。 （1）摇床培养：用接种环从长有未知菌的培养基中刮取未知菌到5ml NA液体培养基试管，摇床培养8-12小时以获得菌液。 （2）梯度稀释：吸取100ul上述菌液和900ulLB液体培养基在1.5ml离心管中震荡混匀后获得终浓度为10-1的菌液；再将此菌液作为母液用上述方法进行稀释，震荡混匀后获得终浓度为10-2的菌液；此后都将新稀释的菌液作为母液，用上述方法进行稀释，震荡混匀后依次获得终浓度为10-1、10-2、10-3和10-4的菌液，同时将这四个菌液作为待纯化的菌液进行平板划线接种。 （3）倒平板：将NA固体培养基融化后，倒10～12mL于灭过菌的培养皿中，待凝固。 （4）涂板分离：将不同浓度的菌液各自培养基中，用5min，放入28度培养箱培养16-24h。 （5）划线分离：用接菌环去不同浓度的菌液分别于相对应的NA无菌平板上进行划线分离，左手取无菌平板一个，用拇指和食指控制皿盖，其余几指控制皿底，打开皿盖，使开口角小于30°，将接种环上的菌种按四个分区进行划线，一区法要求连续划线，且线的边缘应划至培养皿的内缘，线要紧密但不相连。三区或四区法要求每划完一区，都应灼烧接种环，后一区要求与前一区首尾相连，但不得与其他区域搭在一起。 （6）挑取菌株：从培养皿中刮取单菌落到5ml NA液体培养基试管中，培养8-12小时以获得菌液。 五、注意事项 1、配好的培养基应立即高压灭菌，防止杂菌生长，改变培养基的成分。1、实验结果 分离纯化： 纯化培养： 2、讨论分析 从实验的结果上来看，基于实验所用的待测放线菌，划线分离的效率和获得单菌落的可能性都较大于涂布平板方法，仅有划线分离的平板上成功生长出单菌落。原因可能是由于放线菌在液体培养基中的菌丝抱团形成菌丝球在涂布过程中难以被打开导致较难生成单菌落。而在平板培养过程中可以发现待测放线菌菌丝较细，生长缓慢，相互缠绕，形成的菌落质地致密、表面呈较紧密菌落坚实较小而不蔓延1、实验结果 2、分析和讨论 （1）由上三图对比可得待测放线菌呈紫色，与葡萄球菌同属于革兰氏阳性菌。此结果可于后期实验五测序对比得知待测菌种后再次验证。 （2）染色中由于番红染液可能的浓度差异，导致了镜检时阳性菌（葡萄球菌和待测放线菌）除了紫色以外还附着过多的红色，所以复染的步骤不应局限于实验步骤所提供的时间，必要时候须进行多次的重复实验以获得较好的镜检结果。 （3）由于放线菌菌丝质地致密，涂片时需要仔细耐心地将菌落涂开，以观察到细致的待测放线菌视野，不然容易出现菌体高密度凝聚导致无法观察菌体特征。 实验三、纯化后细菌菌株的生长曲线测定 一、实验目的 1、了解细菌生长曲线测定的意义 2、了解测干重法的原理和内容 3、学习用测干重法测定细菌的生长曲线 二、实验原理 以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。是丝状细菌，在摇床液体培养过程形成菌丝球，而呈不均匀分布，所以单细胞细菌的测OD值的方法生长曲线测细胞干重。 2、分析与讨论 （1）由图中长曲线可知，23℃培养时待测放线菌对数生长期应在14-16h之间，培养开始的15h左右具有最大斜率，即23℃培养的第15h细菌具有最大比生长速率。28℃和33℃都无明显的的稳定期，故无法准确判断其对数生长期的范围和最大比生长速率（由图可得明显快于23℃）。但是依旧可以从曲线中大致判断14h时，28℃生长曲线高于33℃，推测待测放线菌的最适生长温度在28℃左右。 （2）本次生长曲线由于课程实验时间限制以及学生自己时间安排原因仅进行了一次测定。同时测定生长曲线过程中的几项称量步骤也不是由同一个人操作，所以造成了测得的生长曲线波动过大，且存在明显的异常点。在条件允许的情况下若出现该问题，应进行重复实验，且每个温度条件下应有2-3个平行。 （3）基于生长曲线于最后6-8h内都出现了明显的衰减期现象。推测原因应该是所用培养基过少（4mL）所致。改