基因表达沉默技术精讲.pptVIP

* 第二节 反义核酸技术 * 1978年，Stephenson 和Zamecnik首次报道了反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的复制现象。 1984 年，Izant weintraub提出了“反义核酸技术”的概念。 Inhibition of Rous sarcoma viralRNA translation by a specific oligodeoxyribonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA , 1978 ;75 : 285 - 288. 历史由来 * 反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序列，包括反义DNA和反义RNA。 基本概念 反义RNA技术 反义DNA技术 * 反义抑制的主要机理 直接作用于靶mRNA的SD序列或部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶H降解。 反义核酸 mRNA RNase H * 论著超过１６０００篇。 基因功能研究（ 1994年流行） 如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。 反义核酸应用 * 1998年8月27日，美国食品药品管理局（FDA）正式批准了由ISIS公司开发的全球第一个反义药物“Vitravene” （福米韦生，fomivirsen）在美国上市。 该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的1000倍，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨细胞视网膜炎,有效率高达80%-90%。 Vitravene为注射剂，患者每月只需注射一次药物（利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为25％，用糖皮质激素治疗可缓解或消除其炎性反应。 2１个硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸组成 ５＇－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３＇ * a.避免内源性核酸酶对其降解 b.提高自身稳定性以及与靶分子的亲和力 H deoxyribose 提高有效性 技术难点 * 第一代硫代修饰（Phosphorothioate） Resisting To Nucleases；Activating RNase H pathways O * 第二代修饰(2’-O-methyl,2’-O-methoxyethyl) Resisting To Nucleases；not activating RNase H pathways * 2001 主要用于治疗老年人中十分常见的视网膜黄斑退化症 Macugen 哌加他尼 * ??2003 新一代抗HIV新药，属于病毒的融合阻止剂类药物 Fuzeon * Tysabri 2004 专治多发性硬化症 * * 第三节 核酶技术 * 核酶（ribozyme） ribonucleic acid enzyme 具有催化活性的RNA，化学本质是RNA,却具有酶的催化功能。 基本概念 * 机体固有同源重组现象的应用使建立基因敲除动物最终成为可能。 * 怎样筛选实现了同源重组的ES细胞呢？ 胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。 * 马里奥·卡佩基(Mario .Capecchi),马丁·埃文斯(Martin J.Evans)和奥利弗·史密斯(Oliver Smithies)从各自不同的研究角度使这项技术成为可能 * 胸腺嘧啶激酶 * 赵老师 药学系药物基因组学教研室 2010.06.18 基因表达沉默技术 * 教学内容及要求 1 2 3 4 反义核酸技术 核酶技术 基因敲除技术 RNA干扰 技术 重点 熟悉 * 参考资料 《基因工程及其分子生物学基础-基因工程分册》，北京大学出版社，静国忠编 自备材料（个人实践经验） * 第一节 RNA干扰技术 * 基本概念 掌握 RNA 干扰 (RNA interference, RNAi):由小双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。 小干扰RNA: 具有干扰功能的这种短双链RNA就称为小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA)。 * 注射 sense 秀丽线虫 antisense 注射 1995年． ． ． ． ． ． 发现历史 * 反义RNA(antisense RNA)对基因抑制效应比较微弱； 而双链RNA（dsRNA）能够高效特异性阻断靶基因的表达。 ． ． ． ． ． ． 1998年 * Craig C. Mello克雷格·梅洛 Andrew Z. Fire 安德鲁·菲尔 2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine * 随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。 RNAi