(学生实验.docVIP

实验一 叶绿体色素的提取、分离及理化性质分析 第一部分 叶绿体色素的提取、分离 一、原理 叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：菠菜、小白菜叶片 （二）仪器设备：1. 研钵；2. 漏斗；3. 三角瓶；4. 剪刀；5. 滴管；6. 培养皿（直径11cm）；7. 康维皿或平底短玻管；8. 圆形滤纸（直径11cm）； （三）试剂：1. 95％乙醇；2. 石英砂；3. 碳酸钙粉；4. 推动剂：按石油醚；丙酮：苯（10:2:1）比例配制（V／V）。 三、实验步骤1 、 叶绿体色素的提取： （1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4～5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。 （2）研钵中加2～3ml 95％乙醇，研磨至糊状，再加10～15ml 95％乙醇，提取35min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95％乙醇冲洗，一同滤于三角瓶中。 2、 叶绿体色素的分离： （1）取圆形定性滤纸一张（直径11cm），在其中心戳一圆形小孔（直径约3mm）另取一张滤纸条（5cm×1.5cm），用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液沿纸条的长度方向涂在纸条的一边，使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，再重复操作数次，然后沿长度方向卷成纸捻，使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。 （2）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿突出）。 （3）在培养皿内放一康维皿，在康维皿中央小室中加入适量的推动剂，把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿。此时，推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。如无康维皿，也可在培养皿中放入一平底短玻管或塑料药瓶盖，以盛装推动剂。所用培养皿底、盖直径应相同，且应略小于滤纸直径，以便将滤纸架在培养皿边缘上。 （4）当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。 四、作业 圆形定性滤纸由内到外的色素圆环依次是何种色素？ 第二部分 叶绿体色素理化性质分析 一、原理 叶绿素是一种二羧酸的酯，在碱的作用下，发生皂化反应，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素的化学性质不稳定，容易受到光的破坏；叶绿素分子吸收光量子转变成不稳定的激发态（第一单线态），当它回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光，故在反射光下叶绿素溶液呈暗红色；叶绿素在弱酸作用下，叶绿素当中的镁可被H+取代而生成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素。 二、仪器与药品 （一）仪器：天平、分液漏斗、酒精灯、试管、试管夹、量筒 （二）药品：醋酸铜粉末、乙醚、浓盐酸、30%KOH甲醇溶液（30gKOH溶解在100mL甲醇溶液中） 三、方法与步骤 将本实验第一项提取的叶绿素溶液用95%酒精稀释一倍，进行以下实验： 1、皂化作用（黄色素和绿色素的分离） 取上述叶绿素丙酮提取液10mL，加到盛有20mL乙醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗并沿漏斗边缘加入30mL蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗，静置片刻，溶液即分为两层。色素已全部转入上层乙醚中，弃去下层丙酮和水，再用蒸馏水冲洗乙醚溶液1-2次，然后于色素乙醚溶液中加5mL30% KOH甲醇溶液，用力摇动分液漏斗，静置约10分钟，再加蒸馏水约10mL，摇动后静置分离，则获得黄色素层和绿色素层，分别保存于试管中。 2、叶绿素的荧光现象 取上述丙酮提取液10mL于试管中，用反射光和透射光，观察提取液的颜色，观察提取液的颜色有何不同，试述原因。 3、H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg的替代作用 取上述丙酮提取液5mL少许于试管中，1滴1滴加入浓盐酸，摇匀，观察溶液颜色的变化（变为褐绿色），到出一半于另一试管中，然后加入醋酸酮晶体1小块，慢慢加热溶液则又产生鲜亮的绿色。此即表明铜已在叶绿素分子中替代了原来镁的位置。 4、对叶绿素的破坏作用（依情况而定） 取两支试管，各注入经丙酮稀释的叶绿体色素溶液2毫升，一支放在直射光下，另一支放在黑暗处，1-2小时后，观察两个试管溶液颜色变化。 取本实验圆形纸层析法分离的色谱一张，通过圆心裁成两半，一半放在直射日光下，另一半放在黑暗中，半小时后比较两张色谱上四种色素的颜色有何变化。 四