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试验目的验证液质联用分析方法（LC-MS\MS）对受试物（HS270）在大鼠血浆中含量测定的准确性和可重现性。 遵从的原则——该实验为非临床试验研究，按照上海睿智化学公司的标准操作规程（SOPs和相关方案（SD大鼠血浆，胆汁，尿和粪便中化合物HS270含量检测的生物分析方法学验证）进行，不完全参照中国SFDA的GLP管理规范来实施，并且不需要质量保证部门的审查。 受试物信息受试物批号纯度游离成盐分子量（盐）分子量（游离）储存条件HS2702010130199.3%盐464.62391.682-8摄氏度,避光保存 内标物信息内标物维拉帕米受试物批号纯度游离成盐分子量(盐)分子量(游离)储存条件维拉帕米021M1429V100%盐491.06454.56冷藏 空白机制试验中所用的空白机制(大鼠血浆、K2EDTA抗凝剂)。都是由上海睿智化学公司动物实验部门提供。 设备与试剂分析仪器（LC-MS/MS） 液相色谱仪、包括溶液输送泵（LC-20AD）、在线脱气仪（DGU-20Ａ2）、自动进样器（SIL-20ＡHT）、控制器（CBM-20A）、柱温箱（CTO-20A）。质谱仪（API4000，美国应用生物系统公司），电喷雾离子源（ESI），串联四级杆质量分析器。数据处理系统为analyst软件（美国应用生物系统公司，软件版本号1.5.1）。其他仪器： 微量分析天平（XP26，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；涡旋振荡器（MULTI-TUBEVORTEXER，Fisher Scientific）;小型台式高速冷冻离心机（5417R，Eppendorf ）；超纯水机（Millipere）：移液器（Eppenderf）。试剂 甲醇（BurdickJacksom，HPLC），甲酸（Jk，水为超纯水。 LC-MS/MS 分析方法液相条件 色谱柱：ACE C18-AR ,5微米 50*2.1mm 分析时间（min）流动相A（%）流动相B（%）0.0150500.150500.55951.25951.2150502.85050色谱流动相A为0.1%甲酸水溶液 B为0.1%甲酸甲醇溶液流速：600微升/分钟 柱温:40摄氏度 选样量:2微升质谱条件离子源:电喷雾离子源 Q1分辨率：Unit Q3分辨率：Unit雾化气（Gas1）：60psi气帘气（CUR）：20psi碰撞气（CAD）：4辅助加热器（Gas2）：65psi离子源电压（IS）：5500v； 离子源温度（TEM）：550摄氏度其他质谱条件质谱条件化合物名Q1Q3Dwell time DPEPCECXPHS270392.2100.215011610316维拉帕米（IS）455.3165.21504910426样品处理方法血浆样品取出后放致室温，涡旋混匀（若有需要，空白样品使用前可离心）。取50微升样品（标曲/质控）至1.5ml离心管中.加入250微升内标溶液(维拉帕米甲醇溶液,空白不加内标补加相同体积甲醇).涡旋混匀离心五分钟(14000转/分钟).取一定量上清液,加到相应的96孔进样板中.LC-MS/MS进样分析. 溶液与样品的配置储备液溶液的配制 HS270储备液A:称取一定量待测物HS270至一定体积容量瓶中,加合适的溶剂使待测物完全溶解后定容,配制成一定浓度的的储备液A(stockA),储备液A储藏在4℃冰箱中待用. HS270储备液B:称取一定量待测物HS270之一定体积容量瓶中, 加合适的溶剂使待测物完全溶解后定容, 配制成一定浓度的的储备液B(stockB),储备液B储存在4℃冰箱中待用. 维拉帕米储备液(内标)：称取一定量的维拉帕米对照品至一定体积容量瓶中，加合适的溶剂使其完全溶解，配制成一定浓度的内标储备液（IS stock）。内标储备液储存在4℃冰箱中待用 试验溶液的配制内标工作溶液配制：吸取一定量的维拉帕米内标至一定量体积容量瓶中。用甲醇定容至刻度后混匀，制得浓度为50mg/m的内标工作溶液. 流动相溶液配制: 流动相A :吸取一定量甲酸至液相色谱中，用量筒量取加一定量纯水，配制成0.1%甲酸水溶液。 流动相B：吸取一定量甲酸至液相色谱中，用量筒量取加一定量甲醇，配制0.1%甲酸甲醇溶液。 洗针溶液配制：用量筒量取一定量甲醇至液相洗瓶中，再加入一定量超纯水，按照1:1比例混合后，制得洗针溶液。标准溶液与标准曲线样品配制 取一定量的HS270储备液A（StockA），用甲醇稀释成溶度为200微升/ml的标准溶液. 取一定量微升200微升/ml的标准溶液,按照1:40的比例,加入到一定量的大鼠空白血浆中.制得溶度为5000微克/ml的标准曲线样品,取5000微克/ml的标准曲线样品,用大鼠空白血浆依次稀释到1000、500、1