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生物化学实验指导
实验一 蛋白质性质实验
【】加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识,了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。【】蛋白质的沉淀反应蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。但是,蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影响下,蛋白质颗粒失去电荷、脱水,甚至变性而丧失稳定因素,即以固态形式从溶液中析出,这种作用称为蛋白质的沉淀反应。该反应可分为以下两种类型(1)可逆沉淀反应在发生沉淀反应时,蛋白质虽已沉淀析出,但其分子内部结构并未发生显著变化,基本上保持原有的性质。沉淀因素除去后,蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。这种沉淀反应为可逆沉淀反应。属于此类反应的有盐析作用;在低温下,乙醇或丙酮对蛋白质的短时间用以及等电点沉淀等。用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体,在高浓度的中性盐影响下,蛋白质分子被盐脱去水化层,同时,蛋白质分子所带的电荷被中和,蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质的性质,若减低盐的浓度时,还能溶解。2)不可逆的沉淀反应在发生沉淀反应时,蛋白质的分子内部结构,空间构象遭到破坏,失去其天然蛋白质的性质,这时蛋白质已发生变性。变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶液中,这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、酸、碱、加热、波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。【实验试剂和器材】(一)试剂1. . 95%乙醇(二)器材试管及试管架,,玻璃漏斗,滤纸,移液管,滴管。【实验】95%乙醇【实验】【】【】-染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色,最大光吸收在465nm,当它与蛋白质结合后变为蓝色,最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合,在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数,使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高,可测微克级蛋白质含量。
【实验试剂和器材】100μg/mL牛血清白蛋白溶液
(2)考马斯亮蓝G-250蛋白试剂:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90%乙醇中,加入85%的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL。
(3)2g绿豆芽研磨后的提取液定容至50mL
【实验】1、标准曲线绘制
取6支试管,按下表加入各试剂。
管号
试剂 0 1 2 3 4 5 100μg/mL牛血清白蛋白溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝液/mL 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 蛋白质含量/μg 0 20 40 60 80 100 加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后,摇匀,放置2min后,在595nm波长下比色测定,记录A595。以各管相应标准蛋白质含量(mg)为横坐标、A595为纵坐标,绘制标准曲线。
2、样品测定
试管中加自制蛋白质样品1.0mL ,再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂,摇匀,放置5min后,在595nm波长下比色,记录A595。
根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。
【实验】μg),按下式计算:
查得的蛋白质含量(μg)×提取液总体积(mL)
样品蛋白质含量(μg/g鲜重)=
样品鲜重(g)×测定时取用的提取液体积(mL)
?【】?(1)如果测定要求很严格,可以在试剂加入后的5~20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。
(2)测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
实验三 糖的性质实验及总糖和还原糖含量测定
【】【】糖是多羟基醛、多羟基酮或它们的缩合物。单糖及分子中含有半缩醛(酮)羟基的二糖都具有还原性,能将Fehling试剂还原成砖红色的Cu2O 沉淀。蔗糖等不含有半缩醛(酮)羟基的糖则无还原性。但蔗糖经水解生成了葡萄糖和果糖,因而水解液具有还原性。多糖是由许多单糖缩合而成的高分子化合物,无还原性。但多糖在酸存在下加热水解,可生成单糖,随之具有还原性。淀粉为一多糖
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